【摘要】：轉(zhuǎn)基因技術(shù)從產(chǎn)生到現(xiàn)在,經(jīng)歷了幾十年的發(fā)展過程,特別是近十年來,更是有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。研究人員對轉(zhuǎn)基因動物的要求已經(jīng)從最初的獲得轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)化成為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)為人類優(yōu)質(zhì)生活服務(wù)的目標(biāo)上來。目的:本實驗研究對象為類胰島素樣生長因子I(IGF-I)轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊及其后代,以導(dǎo)入到宿主體內(nèi)的外源基因IGF-I為研究目標(biāo),通過對IGF-I轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊外源基因的整合位點、拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)錄和翻譯水平進(jìn)行研究,旨在為外源基因的功能研究奠定基礎(chǔ),為轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊的高效生產(chǎn)提供借鑒。方法:試驗一:對本實驗室構(gòu)建的IGF-I轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊及其后代進(jìn)行陽性個體鑒定。根據(jù)外源基因質(zhì)粒序列設(shè)計特異性引物,采用PCR法對本實驗室構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊進(jìn)行陽性個體鑒定。試驗二:利用實時熒光定量PCR技術(shù),設(shè)計實時熒光定量PCR引物,對鑒定結(jié)果為陽性的轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊外源基因拷貝數(shù)進(jìn)行檢測。試驗三:通過相對實時熒光定量PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊皮膚組織IGF-I m RNA表達(dá)水平進(jìn)行分析。試驗四:利用Western免疫印跡法,通過對外源基因在轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊皮膚組織及內(nèi)臟蛋白的表達(dá)定量分析,對外源基因翻譯水平進(jìn)行檢測。試驗五:采用染色體步移技術(shù),提取轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊基因組DNA,對外源基因在IGF-I轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊基因組DNA上的整合位點進(jìn)行分析。結(jié)果:試驗一:結(jié)果表明:轉(zhuǎn)IGF-I基因細(xì)毛羊0152、0016、118、0217四只細(xì)毛羊均為IGF-I轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊。試驗二:結(jié)果表明:IGF-I轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊0152、0016、118、0217外源基因的拷貝數(shù)分別為3、1、1、1。實驗三:結(jié)果表明:IGF-I基因在皮膚組織中的相對表達(dá)量在IGF-I轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊0152、0016、118、0217分別為對照組細(xì)毛羊相對表達(dá)量的2.87倍、2.03倍、1.86倍和1.85倍,差異均極顯著(P0.01)。轉(zhuǎn)基因原代羊0016皮膚組織中IGF-I基因的表達(dá)量分別是一代羊118和0217的178.9%倍和150%,差異極顯著(P0.01);轉(zhuǎn)基因原代羊0152 IGF-I基因在皮膚組織中的相對表達(dá)量分別是其后代118和0217的207%和174%,差異極顯著(P0.01)。原代羊0152與0016皮膚組織中IGF-I基因的相對表達(dá)量差異不顯著(P0.05);一代羊118和0217皮膚組織中的IGF-I基因相對表達(dá)量差異不顯著(P0.05)。實驗四:結(jié)果表明:IGF-I蛋白在IGF-I轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊0152、0016、118、0217皮膚組織的相對表達(dá)量分別為1.55、1.08、0.55、0.62,其表達(dá)量分別為相同年齡普通細(xì)毛羊的213%、187%、129%、127%,差異均極顯著(P0.01)。IGF-I轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊0152內(nèi)臟器官IGF-I蛋白表達(dá)與普通細(xì)毛羊比較結(jié)果顯示:IGF-I蛋白在轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉和皮膚的相對表達(dá)量分別為0.348、2.571、0.863、0.731、0.316、0.124、0.481,普通細(xì)毛羊IGF-I蛋白相對表達(dá)量在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉和皮膚相對表達(dá)量分別為0.357、2.564、0.847、0.727、0.304、0.127、0.215,除在皮膚組織IGF-I蛋白相對表達(dá)量IGF-I轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊0152為普通細(xì)毛羊223.8%,差異極顯著(P0.01),其余組織器官IGF-I蛋白的相對表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊0152和普通細(xì)毛羊之間差異不顯著(P0.05)。實驗五:結(jié)果表明:外源基因插入位點在IGF-I轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊0152基因組DNA第18號染色體7097202-7097206之間。結(jié)論:通過IGF-I轉(zhuǎn)基因細(xì)毛羊基因穩(wěn)定性分析,結(jié)果表明外源基因成功整合到細(xì)毛羊基因組中,并且隨著宿主穩(wěn)定遺傳給其后代。外源基因在轉(zhuǎn)基因原代羊和一代羊體內(nèi)在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平均能夠穩(wěn)定表達(dá),其表達(dá)在皮膚組織具有特異性。
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【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S826

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2434738