【摘要】：精原干細(xì)胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)是雄性成體干細(xì)胞中唯一一種能夠?qū)⑦z傳物質(zhì)傳遞給下一代的干細(xì)胞。SSCs作為生殖干細(xì)胞,是精子發(fā)生的基礎(chǔ),在研究精子發(fā)生機(jī)制、闡述男性不育病因和治療男性不育癥等領(lǐng)域有著不可替代的作用。精原干細(xì)胞的形成受到相關(guān)基因的調(diào)控,但是其具體分子機(jī)制現(xiàn)在仍然未知。本研究針對(duì)精原干細(xì)胞上特異表達(dá)候選基因LBC進(jìn)行功能驗(yàn)證,以如皋黃雞作為試驗(yàn)動(dòng)物,在體外和體內(nèi)通過(guò)敲除和過(guò)表達(dá)LBC基因的方法,研究LBC基因在雞精原干細(xì)胞形成過(guò)程中的作用,為闡明精原干細(xì)胞發(fā)生及分化機(jī)制提供參考。本文主要研究如下:1.如皋黃雞LBC基因的克隆根據(jù)NCBI提供的LBC基因序列,設(shè)計(jì)引物克隆LBC基因的CDS區(qū),并將其連接至pMD19-T載體中進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明pMD19-T-LBC構(gòu)建正確,與公布的原雞LBC基因CDS區(qū)同源性達(dá)99.43%,編碼氨基酸有兩個(gè)發(fā)生改變,成功克隆出如皋黃雞中LBC基因,可用于后續(xù)研究。2.LBC基因多克隆抗體制備及亞細(xì)胞定位研究制備LBC基因的抗原多肽,注射小鼠進(jìn)行免疫,收集血清后通過(guò)間接免疫熒光技術(shù)(IFA)進(jìn)行抗體效價(jià)檢測(cè);構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP-N1-LBC,轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞48h后于熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果,并利用RT-PCR和間接免疫熒光試驗(yàn)進(jìn)一步鑒定LBC-eGFPmRNA和蛋白水平的表達(dá)狀況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),RT-PCR能檢測(cè)到融合蛋白轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá),熒光顯微鏡觀察和IFA檢測(cè)結(jié)果都顯示LBC-eGFP融合蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有表達(dá),與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果相一致。3.LBC基因?qū)杉?xì)胞形成的影響構(gòu)建LBC敲除載體CRISPR/Cas9-LBC和過(guò)表達(dá)載體pcDNA3.0-LBC,轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞后利用測(cè)序、T7E1酶切和Western Blot技術(shù)驗(yàn)證載體活性;分別轉(zhuǎn)染ESC,在RA誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng),采用形態(tài)學(xué)觀察、免疫化學(xué)檢測(cè)和QRT-PCR等方法在體外檢測(cè)LBC缺失與過(guò)表達(dá)對(duì)ESC向SSC分化的影響,同時(shí)雞胚注射CRISPR/Cas9-LBC和pcDNA3.O-LBC載體,采用石蠟切片和流式分析的方法在體內(nèi)檢測(cè)LBC缺失與過(guò)表達(dá)對(duì)PGCs和SSCs形成的影響。結(jié)果表明CRISPR/Cas9-LBC和pcDNA3.0-LBC載體均構(gòu)建成功且具有活性;體外實(shí)驗(yàn)中,與RA誘導(dǎo)組相比,LBC過(guò)表達(dá)顯著地促進(jìn)了ESC向SSC的分化,且integrin α6、integrinβ1等SSCs標(biāo)記基因的表達(dá)量也有顯著的增加,在第10天,相對(duì)于誘導(dǎo)組中integrinα6的相對(duì)表達(dá)量(1.96),在過(guò)表達(dá)組中達(dá)到2.34;相反的,LBC敲除,ESCs向SSCs的分化受到一定程度的抑制,第6天克隆形成之后,不能形成精原樣細(xì)胞,且全能性標(biāo)記基因Sox2的表達(dá)量的降低受到抑制,相對(duì)于誘導(dǎo)組中相對(duì)表達(dá)量(0.96),在敲除組中達(dá)到1.03,integrinα6、integrinβ1表達(dá)量也相對(duì)減少;體內(nèi)試驗(yàn)中,與正常發(fā)育的雞胚相比,LBC過(guò)表達(dá)顯著的促進(jìn)了PGC和SSC細(xì)胞的生成,而LBC敲除相對(duì)減少了 PGC和SSC細(xì)胞的生成。
[Abstract]:Spermatogonial stem cells (Spermatogonial stem cells,SSCs) are the only male adult stem cells that can transfer genetic material to the next generation of stem cells as reproductive stem cells, which is the basis of spermatogenesis, in the study of the mechanism of spermatogenesis. Expounding the causes of male infertility and the treatment of male infertility and other fields has an irreplaceable role. The formation of spermatogonial stem cells is regulated by related genes, but the molecular mechanism of spermatogonial stem cells is still unknown. In this study, the specific expression of candidate gene LBC on spermatogonial stem cells was verified by knockout and over-expression of LBC gene in vitro and in vivo, using Rugao yellow chicken as experimental animal. To study the role of LBC gene in the formation of chicken spermatogonial stem cells and to provide a reference for elucidating the mechanism of spermatogonial stem cell development and differentiation. The main research in this paper is as follows: 1. The cloning of LBC gene of Rugao yellow chicken was based on the sequence of LBC gene provided by NCBI. The primers were designed to clone the CDS region of LBC gene and cloned into pMD19-T vector for sequencing. The sequencing results showed that the pMD19-T-LBC was constructed correctly and had 99.43% homology with the published CDS region of the original chicken LBC gene. Two amino acids were changed and the LBC gene in Rugao yellow chicken was cloned successfully. 2. Preparation of polyclonal antibody against LBC gene and subcellular localization study to prepare antigen polypeptide of LBC gene, immunize mice, collect serum and detect antibody titer by indirect immunofluorescence technique (IFA); The eukaryotic expression vector pEGFP-N1-LBC, was constructed and transfected into DF-1 cells for 48 hours. The transfection results were observed under fluorescence inversion microscope, and the expression of LBC-eGFPmRNA and protein were further identified by RT-PCR and indirect immunofluorescence assay. The results showed that RT-PCR could detect the expression of fusion protein at transcriptional level. The results of fluorescence microscopy and IFA showed that LBC-eGFP fusion protein was expressed in both nucleus and cytoplasm. 3. The effect of LBC gene on the formation of spermatogonial stem cells is consistent with the predicted results of bioinformatics. 3. LBC knockout vector CRISPR/Cas9-LBC and over-expression vector pcDNA3.0-LBC, were transfected into DF-1 cells and sequenced. The activity of the vector was verified by T7E1 digestion and Western Blot. The transfected ESC, were cultured in RA-induced medium. The effects of LBC deletion and over-expression on the differentiation of ESC into SSC were detected by morphological observation, immunochemical assay and QRT-PCR in vitro. At the same time, CRISPR/Cas9-LBC and pcDNA3.O-LBC vectors were injected into chicken embryos. Paraffin sections and flow cytometry were used to detect the effect of LBC deletion and overexpression on the formation of PGCs and SSCs in vivo. The results showed that both CRISPR/Cas9-LBC and pcDNA3.0-LBC vectors were constructed successfully and had activity. In vitro, compared with RA-induced group, the over-expression of LBC significantly promoted the differentiation of ESC into SSC, and the expression of integrin 偽 6, integrin 尾 1 and other SSCs-labeled genes also increased significantly on the 10th day, and the expression of integrin 偽 6, integrin 尾 1 and other SSCs-labeled genes were significantly increased on the 10th day. The relative expression of integrin 偽 6 in the overexpressing group was 2.34 compared with that in the induced group (1.96). On the contrary, LBC knockout and ESCs differentiation into SSCs were inhibited to a certain extent. After 6 days of cloning, spermatogonia-like cells could not be formed, and the decrease of the expression of totipotency marker gene Sox2 was inhibited. Compared with the induction group (0.96), the expression of integrin 偽 6 and integrin 尾 1 in the knockout group was 1.03, and the expression level of integrin 尾 1 was also decreased in the knockout group. In vivo, compared with normal chicken embryos, over-expression of LBC significantly promoted the production of PGC and SSC cells, while LBC knockout decreased the production of PGC and SSC cells.
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S831

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10 班文贊;樹(shù)，

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