【摘要】：A亞群禽白血病(Avian leukosis,AL)是由A亞群禽白血病病毒(ALV-A)引起的傳染性腫瘤病病,可造成感染雞群的免疫力下降、產(chǎn)蛋率和蛋品質(zhì)降低、生長(zhǎng)遲緩等。該病在我國(guó)雞群中廣泛流行,對(duì)我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重威脅。我國(guó)政府和科技工作者對(duì)該病高度重視,采取凈化種雞群、阻斷垂直傳播的防控策略來控制該病。由于缺乏針對(duì)ALV-A特異性診斷試劑和疫苗抗原,限制了對(duì)該病的凈化檢測(cè)和疫苗防治的研究。本研究利用ALV-A gp85基因進(jìn)行了A亞群?jiǎn)慰寺】贵w的制備與ALV-A基因工程亞單位疫苗抗原的免疫保護(hù)作用評(píng)價(jià)試驗(yàn),為建立ALV-A特異性診斷方法和探索新型防治方法提供科學(xué)依據(jù)。ALV-A gp85基因的克隆與表達(dá)。根據(jù)已發(fā)表基因序列,設(shè)計(jì)引物,從感染ALV-A-SDAU09C1病毒的DF1細(xì)胞中獲得病毒全基因組DNA,以此為模板擴(kuò)增獲得大小為909bp的gp85目的基因,利用該基因構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒(pET32a-SDAU09C1-gp85),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后獲得高效表達(dá)的大小約為46KD的目的蛋白;該蛋白經(jīng)純化、乳化后制備成免疫抗原。ALV-A gp85重組蛋白抗原的免疫保護(hù)性研究。將純化后的gp85重組蛋白與不同佐劑(弗氏佐劑和CpG佐劑)進(jìn)行乳化、混合,制備ALV-A免疫原,免疫60周齡農(nóng)大三號(hào)種母雞,首次免疫后每隔3周進(jìn)行兩次加強(qiáng)免疫,于首免后每周檢測(cè)血清ALV-A抗體,并與卵黃抗體比較分析。對(duì)種雞進(jìn)行人工授精,收集受精種蛋、孵化,對(duì)孵化的1日齡雛雞進(jìn)行攻毒。攻毒后4周對(duì)雛雞進(jìn)行病毒血癥、泄殖腔棉拭子p27進(jìn)行檢測(cè),并觀察雞只狀態(tài)及統(tǒng)計(jì)死亡率,同時(shí)進(jìn)行血清抗體病毒中和試驗(yàn)。結(jié)果顯示:(1)使用ALV-A gp85重組蛋白與不同佐劑可以誘導(dǎo)全部種雞產(chǎn)生較高效價(jià)的血清抗體和卵黃抗體,其中CpG佐劑聯(lián)合免疫組效果優(yōu)于其它免疫組。(2)gp85聯(lián)合CpG佐劑組與對(duì)照組相比,雛雞的病毒血癥、泄殖腔排毒率和死亡率均顯著降低。(3)體外病毒中和試驗(yàn)表明,誘導(dǎo)產(chǎn)生的雛雞體內(nèi)母源抗體可以中和ALV-A病毒,其中和作用與抗體滴度高低呈現(xiàn)正相關(guān);免疫熒光分析(IFA)試驗(yàn)證實(shí)抗體與病毒的結(jié)合。ALV-A單克隆抗體的制備。以制備的gp85重組蛋白抗原免疫6周齡雌性BALB/c小鼠,三次加強(qiáng)免疫后制備脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合、篩選,獲得一株分泌抗ALV-A抗體的雜交瘤細(xì)胞株,命名為A14GZ。對(duì)該單抗進(jìn)行ELISA效價(jià)測(cè)定、IFA和免疫組化方法鑒定,結(jié)果顯示:(1)ELISA法測(cè)定的細(xì)胞上清效價(jià)為1:26,腹水效價(jià)為1:213;(2)IFA鑒定顯示該單抗能特異性識(shí)別ALV-A病毒;不與ALV-J、ALV-B結(jié)合(3)取已知感染ALV-A病毒雞只的心肌組織,制作切片,并作A亞群?jiǎn)慰寺】贵w介導(dǎo)的IFA檢測(cè),可見心肌細(xì)胞質(zhì)特異性綠色熒光。以上結(jié)果表明,利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功的獲得了具有良好免疫原性的ALV-A gp85重組蛋白,聯(lián)合佐劑能夠誘導(dǎo)雞體產(chǎn)生的較高ALV-A血清抗體和母源抗體,對(duì)后代雛雞具有較好的抗ALV-A早期感染的作用,保護(hù)率可達(dá)80%。同時(shí),利用ALV-A gp85重組蛋白獲得一株能穩(wěn)定分泌ALV-A單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株A14GZ,分泌的抗體可用于ALV-A感染的鑒別診斷。
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【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李薛;李衛(wèi)華;趙鵬;崔治中;王鑫;董宣;;B亞群禽白血病病毒滅活疫苗的免疫效力分析[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào);2012年11期

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本文編號(hào)：2429525