【摘要】：布魯氏菌病主要引起家畜的流產(chǎn)、死胎、睪丸炎等癥狀,給畜牧業(yè)的生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。布魯氏菌沒有典型的外毒素,其毒力主要表現(xiàn)在對(duì)宿主細(xì)胞的侵襲力和自身繁殖力上。外膜蛋白是布魯氏菌的主要毒力因子,與細(xì)菌的黏附和定殖密切相關(guān)。OMP25蛋白是布魯氏菌中重要的外膜蛋白,在維持細(xì)菌自身結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和展現(xiàn)細(xì)菌毒力上有重要作用,缺失OMP25蛋白后,布魯氏菌的毒力明顯下降。MAPK信號(hào)通路是普遍存在于真核細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,可以被病原菌、細(xì)胞因子等信號(hào)激活,產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)旨在研究外膜蛋白OMP25與MAPK信號(hào)通路的關(guān)系,了解外膜蛋白對(duì)信號(hào)通路的激活情況,以及對(duì)細(xì)胞因子分泌的影響,為進(jìn)一步研究布魯氏菌的致病機(jī)制提供理論依據(jù)。圍繞以上觀點(diǎn)開展如下研究:篩選并鑒定布魯氏菌OMP25缺失株和2308侵染人胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞時(shí)顯著表達(dá)的細(xì)胞因子。建立布魯氏菌OMP25缺失株和2308侵染人胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞模型,采用ELISA方法檢測(cè)侵染后0 h,8 h,24 h,48 h的細(xì)胞上清液中的細(xì)胞因子,確定分泌量差異顯著的細(xì)胞因子。結(jié)果顯示,OMP25組、2308組和PBS對(duì)照組的IL-10,IL-1β在各個(gè)時(shí)間段的差異均不顯著;在侵染4 h時(shí),OMP25缺失株侵染組IL-1的釋放量顯著低于2308侵染組(P0.05);與2308組相比,OMP25組TNF-α的釋放量在4 h,8 h,24 h,4 8h均差異顯著。研究表明布魯氏菌侵染宿主細(xì)胞過程中外膜蛋白OMP25與細(xì)胞因子TNF-α的釋放量密切相關(guān)。分析布魯氏菌OMP25對(duì)MAPK信號(hào)通路的影響。建立布魯氏菌OMP25缺失株和2308侵染人胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞(HPT-8)模型,收集侵染細(xì)胞總蛋白,定量后進(jìn)行磷酸化檢測(cè)。用濃度為10μM的信號(hào)通路抑制劑孵育細(xì)胞1 h,用牛種布魯氏菌布魯氏菌OMP25缺失株和強(qiáng)毒株2308以100:1的比例侵染細(xì)胞。ELISA法檢測(cè)侵染細(xì)胞4 h,8 h,24 h,48 h后細(xì)胞上清液中的TNF-α的含量,進(jìn)一步通過阻斷實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示:在26個(gè)磷酸化的蛋白中,2308激活了GSK-3a/b、JNK、p38、P70S6Kinase、RSK2、HSP27磷酸化位點(diǎn)。OMP25缺失株激活了p38γ通路相關(guān)的蛋白磷酸化位點(diǎn)。抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,加入p38抑制劑后,OMP25缺失株侵染組與2308侵染組TNF-α分泌量均降低;加入JNK和ERK抑制劑后,OMP25缺失株侵染組中TNF-α變化不明顯。研究表明布魯氏菌OMP25缺失株和布魯氏菌2308株激活了MAPK信號(hào)通路中的p38支路,且TNF-α的產(chǎn)生和p38有關(guān)。檢測(cè)布魯氏菌OMP25缺失株和2308株感染小鼠時(shí)MAPK信號(hào)通路的激活情況,進(jìn)一步闡述OMP25在MAPK信號(hào)通路激活機(jī)制的作用。采用腹腔注射法對(duì)雌性小鼠用布魯氏菌OMP25缺失株和2308株進(jìn)行感染,收集感染小鼠外周血,并通過血清檢測(cè)Ig G和TNF-α的釋放量,病理切片觀察布魯氏菌OMP25缺失株和親本株2308對(duì)小鼠的影響,對(duì)布魯氏菌侵染后影響的MAPK信號(hào)通路進(jìn)行免疫組化分析。結(jié)果顯示布魯氏菌OMP25缺失株和2308株感染組小鼠后血清中TNF-α的釋放量均低于對(duì)照組。病理切片結(jié)果顯示與OMP25缺失株組相比,2308感染組出現(xiàn)明顯的病理變化。免疫組化結(jié)果顯示,OMP25缺失株和2308株侵染的小鼠子宮內(nèi)膜均有MAPK信號(hào)通路p38支路和ERK支路的磷酸化。結(jié)果表明布魯氏菌2308親本株和OMP25缺失株均促進(jìn)了TNF-α的表達(dá),同時(shí)激活了MAPK信號(hào)通路p38和ERK支路。
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【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.61

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2429083