【摘要】：傳染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)引起的一種急性傳染病,主要易感動物為3-6周齡雛雞,病毒感染后主要在法氏囊內(nèi)增殖。該病不但能使感染動物死亡,還能產(chǎn)生免疫抑制,降低感染動物抵抗力,使其受其他病毒感染的風(fēng)險增加。而且IBDV易變異,動物發(fā)病之后又難以根除,加上多種禽鳥類可帶毒傳播,給養(yǎng)禽業(yè)造成重大損失。及早進(jìn)行疫苗免疫接種,及時了解雞群IBDV抗體水平是防控該病的有效手段。因此本研究旨在從兩個方向?qū)BD的防控進(jìn)行研究,一方面利用慢病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建過表達(dá)gga-miR-9基因的DF-EGFP-miR-9細(xì)胞并進(jìn)行純化,檢測細(xì)胞內(nèi)IBDV表達(dá)的效率,探究其用于病毒生產(chǎn)的可能;另一方面利用昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)IBDVVP3蛋白,并對VP3蛋白的ELISA抗原反應(yīng)性進(jìn)行研究,探究VP3-ELISA用于檢測雞群IBDV抗體水平的能力。實驗一:過表達(dá)gga-miR-9基因的DF-1細(xì)胞株的構(gòu)建及純化為研究過表達(dá)gga-miR-9基因的DF-1細(xì)胞對病毒復(fù)制的影響,本研究利用PCR方法從雞的基因組中擴(kuò)增出pri-gga-miR-9基因,插入到慢病毒載體質(zhì)粒pL-EGFP中,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pL-EGFP-miR-9,并與pC-GP、pR-Rev和pVSVG三個包轉(zhuǎn)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞,制備含gga-miR-9基因的重組慢病毒VL-EGFP-miR-9。將VL-EGFP-miR-9感染DF-1細(xì)胞,經(jīng)殺稻瘟菌素篩選、流式細(xì)胞儀分選純化獲得過表達(dá)gga-miR-9的DF-EGFP-miR-9細(xì)胞。熒光顯微鏡下觀察,分選后DF-EGFP-miR-9細(xì)胞形態(tài)正常,細(xì)胞熒光強(qiáng)度和密度顯著提升。用MTT法測定并繪制細(xì)胞的生長曲線,分選后DF-EGFP-miR-9細(xì)胞生長狀態(tài)與正常DF-1無差異。qRT-PCR檢測細(xì)胞中g(shù)ga-miR-9的表達(dá),結(jié)果表明分選后的DF-EGFP-miR-9細(xì)胞中g(shù)ga-miR-9的表達(dá)量比未分選的gga-miR-9高40倍,比正常DF-1細(xì)胞高500倍。將IBDV接種于已分選的DF-EGFP-miR-9細(xì)胞,72h后收取上清檢測病毒滴度,結(jié)果顯示病毒滴度(109.25 TCID50/0.1mL)高于未分選細(xì)胞(108 TCID50/0.1mL)和正常 DF-1 細(xì)胞(106.875 TCID50/0.1mL)。本實驗結(jié)果表明:經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分選的DF-EGFP-miR-9細(xì)胞能穩(wěn)定過表達(dá)gga-miR-9,還能顯著提高培養(yǎng)產(chǎn)生的病毒滴度。實驗二:傳染性法氏囊病病毒vp3基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)及其ELISA抗原反應(yīng)性的分析為分析傳染性法氏囊病病毒(IBDV)重組VP3蛋白的ELISA抗原反應(yīng)性,將IBDV vp3基因插入桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)供體質(zhì)粒pFastBacHTA中,構(gòu)建重組供體質(zhì)粒pFastBacHTA-vp3并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)菌,經(jīng)抗性篩選獲得重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒pBac-vp3。用pBac-vp3轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞,獲得重組桿狀病毒vBac-vp3。對重組桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞用Western-blot檢測,在33ku處存在一條特異的蛋白條帶;用間接免疫熒光試驗檢測時可見特異性熒光。以純化的重組VP3蛋白為包被抗原建立了檢測IBDV抗體的間接ELISA(VP3-ELISA),并與重組VP2蛋白包被抗原建立的VP2-ELISA和全病毒抗原ELISA(IDEXX-ELISA)進(jìn)行了比較。對42份不同雞血清中IBDV抗體檢測結(jié)果顯示,VP3-ELISA的區(qū)分度低于VP2-ELISA和IDEXX-ELISA;VP3-ELISA 陽性檢出率低于 VP2-ELISA 和 IDEXX-ELISA;VP3-ELISA 與 IDEXX-ELISA 的相關(guān)系數(shù)低于 VP2-ELISA 與 IDEXX-ELISA 的相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明,在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的重組VP3蛋白具有良好的特異性和抗原反應(yīng)性,用它建立的ELISA抗原反應(yīng)性弱于重組VP2蛋白和IBDV全病毒抗原建立的ELISA抗原反應(yīng)性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2428422