發(fā)布時間：2019-02-20 20:41

【摘要】：剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種專性細胞內(nèi)寄生蟲,能夠感染多種哺乳動物和鳥類,并引發(fā)弓形蟲病(Toxoplasmosis)。全世界有近三分之一的人感染弓形蟲。免疫功能不全的病人感染弓形蟲后將會引起生命危險,先天性感染會引起胎兒流產(chǎn)或死胎。此外,一些精神疾病的發(fā)生也與弓形蟲感染有關。弓形蟲病對畜牧業(yè)的危害也很大,懷孕期間的羊和豬感染弓形蟲后,經(jīng)常導致流產(chǎn)、死胎,造成相當大的經(jīng)濟損失。雞作為弓形蟲的一種不敏感宿主,一直以來雞弓形蟲病因為其大多數(shù)為隱性感染而未受到足夠的重視。然而,散養(yǎng)雞群的弓形蟲感染率極高,加上弓形蟲能夠在雞體內(nèi)長時間存活,攝入被弓形蟲污染的雞肉可能會導致人和其他動物的感染。目前,有關雞弓形蟲病的研究主要集中在流行病學調(diào)查和基因型分析等方面。然而,雞的日齡與弓形蟲感染之間的關系很少有報道。同時,有關雞弓形蟲病的藥物治療幾乎沒有報道。為了尋找最合適的日齡用于雞弓形蟲病模型的建立,在此基礎上再進行治療雞弓形蟲病的藥物篩選,為雞弓形蟲病模型的建立和雞弓形蟲病的防治奠定基礎,特進行了如下研究:1.兩種不同來源弓形蟲蟲株對不同日齡雛雞的致病性比較本研究擬通過弓形蟲蟲株對不同日齡雛雞的致病性比較,探討弓形蟲的致病性與感染日齡的關系,確定用于急、慢性雞弓形蟲病模型建立最合適的日齡。分別用RH和JS兩個弓形蟲蟲株的速殖子按照1×108個/羽的劑量腹腔感染7、14、21、28日齡雛雞,同時設陰性對照組,僅注射生理鹽水;攻蟲后每日觀察實驗雞的臨床癥狀,記錄每組雞的死亡情況;利用ELISA方法檢測各組實驗雞的弓形蟲循環(huán)抗原(T.gondii circulating antigens,TCA)和弓形蟲循環(huán)抗體(T.gondii circulating antibodies,TCAb),PCR方法對53天未死亡的雞進行檢測,對急性死亡和53天未死亡的雞進行病理組織切片,觀察組織病變。結(jié)果發(fā)現(xiàn),7日齡組雛雞感染弓形蟲后多呈急性死亡,JS株的死亡率(100%)顯著高于RH株(70%);14日齡組雛雞感染后有輕微臨床癥狀,但無死亡;21、28日齡組實驗雞感染JS株和RH株后均未出現(xiàn)臨床癥狀和死亡。所有實驗組的TCA和TCAb分別在感染后第4天和第11天轉(zhuǎn)為陽性。21日齡組(RH株)和28日齡組的(RH株和JS株)的TCA和TCAb早于其它實驗組降到陰性水平。7、14、21日齡組存活的雞均可檢測到弓形蟲特異性DNA。28日齡組,RH株和JS株分別有3只和1只為PCR陰性。研究結(jié)果表明,雛雞的日齡對弓形蟲的致病性具有重要的影響,且日齡越小,弓形蟲的致病性越強。7至14日齡的雛雞可用于急性雞弓形蟲病模型的建立;14至28日齡的雛雞可用于慢性雞弓形蟲病模型的建立。2.雞源弓形蟲治療藥物的篩選為了篩選能有效治療雞弓形蟲病的藥物,本研究首先利用ICR品系小鼠模型進行藥物初篩,在此基礎上,挑選抗小鼠弓形蟲感染效果最好、中等、較差的三種藥物或藥物配伍治療雞弓形蟲感染并做出合理評價。用剛地弓形蟲RH和JS株速殖子,按1×104/鼠和1×108/雞分別腹腔接種小鼠和雞,接種后4 h用藥組通過灌服或飲水給藥,連續(xù)用藥5d,接種后20d或10d結(jié)束實驗,根據(jù)存活率、平均存活時間等指標得出療效。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在抗小鼠弓形蟲感染試驗中,磺胺氯吡嗪鈉+甲氧芐啶組治療效果最佳,阿奇霉素次之,其余藥物抗弓形蟲作用不明顯。在抗雞弓形蟲感染試驗中,阿奇霉素和磺胺氯吡嗪鈉+甲氧芐啶組均能顯著提高雛雞的存活率,前者(44.4%)略高于磺胺氯吡嗪鈉+甲氧芐啶組(33.3%),但兩者無明顯差異(P0.05)。研究結(jié)果表明,阿奇霉素和磺胺氯吡嗪鈉聯(lián)合甲氧芐啶對雞弓形蟲感染有明顯治療效果。弓形蟲排泄分泌抗原(excretory/secretory antigens,ESA)在弓形蟲入侵宿主的早期就開始分泌,在入侵過程中發(fā)揮重要作用。由于排泄分泌抗原具有很好的免疫原性,現(xiàn)已廣泛用于弓形蟲病的診斷。免疫排泄分泌抗原可誘導機體產(chǎn)生強烈的體液、細胞免疫應答反應,可用于弓形蟲病的免疫預防。此外,ESA還具有抗腫瘤等重要作用。到目前為止,有關弓形蟲排泄分泌抗原對宿主細胞的調(diào)節(jié)作用的研究還相對較少,對巨噬細胞的調(diào)節(jié)作用研究幾乎沒有;同時分析和鑒定結(jié)合宿主細胞的排泄分泌抗原,對于進一步理解排泄分泌抗原的功能以及其如何發(fā)揮作用的機制是至關重要的。因此,我們進行了以下研究:3.弓形蟲排泄分泌抗原對小鼠巨噬細胞免疫功能調(diào)節(jié)研究本部分研究旨在觀察弓形蟲排泄分泌抗原對小鼠單核巨噬細胞Ana-1免疫功能的影響。用不同濃度的弓形蟲排泄分泌抗原分別與小鼠巨噬細胞Ana-1共培養(yǎng),觀察不同處理對Ana-1細胞增殖和吞噬的影響,用ELISA檢測不同處理后的Ana-1細胞上清中IL-1β、IL-10、TNF-α和TGF-β1的表達,并用流式細胞術(shù)檢測作用后的Ana-1細胞表面Toll樣受體分子表達水平的變化以及是否促進細胞的凋亡。結(jié)果顯示,弓形蟲排泄分泌抗原能夠顯著抑制小鼠巨噬細胞的增殖和吞噬功能,并顯著誘導細胞產(chǎn)生凋亡。ESA作用Ana-1巨噬細胞后,下調(diào)了細胞因子TNF-α和IL-1β的分泌,同時上調(diào)了細胞因子TGF-β1和IL-10的分泌。ESA作用Ana-1巨噬細胞后,Ana-1細胞表面的Toll樣受體2和4的活化受到抑制,NO的分泌也受到抑制。此外,弓形蟲ESA可以抑制LPS誘導的Ana-1巨噬細胞中NF-κB的激活。結(jié)果表明,弓形蟲ESA在體外可顯著調(diào)節(jié)Ana-1細胞的免疫功能。4.弓形蟲排泄分泌抗原小鼠巨噬細胞結(jié)合分子的鑒定本研究的目的是鑒定剛地弓形蟲排泄分泌抗原中能與小鼠巨噬細胞(Ana-1細胞)結(jié)合的分子,并分析其蛋白功能。ESA與Ana-1細胞孵育后,免疫熒光試驗檢測ESA與Ana-1細胞的結(jié)合情況。通過免疫共沉淀試驗來收集與Ana-1細胞結(jié)合的ESA,用鳥槍法--液相色譜質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用(shotgunLC-MS/MS)進行蛋白的質(zhì)譜鑒定,并用生物信息學分析其功能。結(jié)果表明,ESA能夠結(jié)合到Ana-1細胞的表面,其中共有109種弓形蟲蛋白被鑒定。生物信息學分析顯示,共有57種蛋白被成功功能注釋,其中40種(70.2%)蛋白有結(jié)合活性,31種(54.4%)蛋白有催化活性。這些蛋白可能參與到宿主細胞的入侵以及宿主細胞的功能調(diào)節(jié)過程中。這些研究結(jié)果為我們進一步了解弓形蟲和宿主細胞--巨噬細胞之間的相互作用關系奠定基礎,同時也為更好的闡明弓形蟲致病的分子機制提供依據(jù)。5.剛地弓形蟲TgEF-1α和TgESA10基因的克隆、表達及免疫保護性研究從上述鑒定的蛋白中選取弓形蟲延伸因子-1α(elongation factor-1 alpha,EF-1α)和10 kDa排泄分泌抗原(10 kDa excretory-secretory antigen,ESA10),進行TgEF-1α和TgESA10基因的克隆、表達及免疫保護性研究。利用PCR技術(shù)擴增到TgEF-1α基因(GenBank accession:XM_002370208.1)和TgESA10基因(GenBank accession:HM014013.1)。序列分析表明TgEF-1α基因的ORF含1347 bp,編碼448個氨基酸,理論分子量49.04 kDa;TgESA10基因的OR/F含390 bp,編碼130個氨基酸,理論分子量14.69kDa。構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET32a(+)-EF-1α和pET32a(+)-ESA10,均在大腸桿菌BL21(DE3)中成功獲得了表達,重組蛋白rTgEF-1α以包涵體形式存在,重組蛋白rTgESA10存在于上清中。Western印跡顯示表達的重組蛋白rTgEF-1α和rTgESA10,均能被感染弓形蟲的雞血清所識別,并且能檢測到天然狀態(tài)下這兩種蛋白的存在。小鼠分別被動免疫抗rTgEF-1α和rTgESA10多克隆抗體后感染弓形蟲速殖子,小鼠的存活時間均顯著延長。分別用抗rTgEF-1α和rTgESA10多克隆抗體作用過的弓形蟲速殖子感染小鼠后,小鼠的存活時間均顯著延長;分別用抗rTgEF-1α和rTgESA10多克隆抗體作用過的弓形蟲速殖子感染小鼠巨噬細胞,陽性巨噬細胞感染數(shù)和細胞內(nèi)速殖子量均顯著減少。動物保護實驗的結(jié)果顯示,BALB/c小鼠免疫重組蛋白rTgEF-1α和rTgESA10后,小鼠體內(nèi)均產(chǎn)生高水平的抗弓形蟲抗體、干擾素-γ、白細胞介素-4;CD4+和CD8+T細胞的百分比以及MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子的表達水平顯著增加(P0.05);感染弓形蟲RH株速殖子后,對照組小鼠均在8天之內(nèi)死亡,rTgEF-1α蛋白免疫組小鼠的存活時間顯著延長至14.53±1.72天(P0.05),rTgESA10蛋白免疫組小鼠的存活時間顯著延長至14.13±1.63天(P0.05)。這些結(jié)果表明,TgEF-1α和TgESA10均在弓形蟲入侵宿主細胞過程中發(fā)揮重要作用,并能夠激起小鼠產(chǎn)生強烈的體液免疫和細胞免疫應答,可以作為預防治療弓形蟲病的蛋白疫苗候選分子。6.剛地弓形蟲TgEF-1α基因和TgESA10基因DNA疫苗的構(gòu)建及免疫保護性研究本部分研究分別構(gòu)建了弓形蟲pVAX-EF-1α和pVAX-ESA10 DNA疫苗,并評價了其對急性弓形蟲病的免疫保護性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),單獨免疫pVAX-EF-1α和pVAX-ESA10的小鼠,體內(nèi)均產(chǎn)生高水平的抗弓形蟲抗體、干擾素-γ、白細胞介素-4和白細胞介素-17;CD4+和CD8+T細胞的百分比以及MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子的表達水平均顯著增加(P0.05)。感染弓形蟲RH株速殖子后,對照組小鼠均在8天之內(nèi)死亡,pVAX-EF-1α免疫組小鼠的存活時間顯著延長至14.1±1.7天(P0.05),pVAX-ESA10免疫組小鼠的存活時間顯著延長至14.3±1.7天(P0.05)。這些結(jié)果表明,DNA疫苗pVAX-EF-1α和pVAX-ESA10均能夠激起小鼠產(chǎn)生強烈的體液免疫和細胞免疫應答,并且對小鼠急性弓形蟲感染產(chǎn)生部分免疫保護力,這表明TgEF-1α和TgESA10可以作為預防治療弓形蟲病的DNA疫苗候選分子。7.四種弓形蟲重組蛋白rTgESA10、rTgEF-1α、rTg14-3-3和rTgCDPK1調(diào)節(jié)小鼠巨噬細胞免疫功能的研究本部分研究先進行了弓形蟲鈣依賴蛋白激酶1(calcium-dependent protein kinase 1,CDPK1)和14-3-3蛋白(14-3-3)的基因克隆、表達和純化,然后觀察四種弓形蟲重組蛋白rTgESA10、rTgEF-1α、rTg14-3-3和rTgCDPK1對小鼠單核巨噬細胞Ana-1免疫功能的影響。分別用不同濃度的rTgESA10、rTgEF-1α、rTg14-3-3和rTgCDPK1與小鼠巨噬細胞Ana-1共培養(yǎng),觀察不同處理對Ana-1細胞增殖和吞噬的影響,用ELISA檢測不同處理后的Ana-1細胞上清中IL-1β、IL-10、TNF-α和TGF-β1的表達,并用流式細胞術(shù)檢測作用后的Ana-1細胞表面Toll樣受體分子表達水平的變化以及是否促進細胞的凋亡。結(jié)果顯示,rTgESA10、rTg14-3-3和rTgCDPK1刺激Ana-1細胞后,細胞的增殖均受到顯著抑制;rTgEF-1α對Ana-1細胞的增殖活性幾乎沒有影響。Ana-1細胞經(jīng)rTgESA10刺激后,細胞TQ噬FITC-dextran的能力顯著增加;經(jīng)rTg14-3-3和rTgCDPK1刺激后,細胞吞噬FITC-dextran的能力均顯著下降;rTgEF-1α對Ana-1細胞吞噬功能的影響較小。高濃度的rTgESA10和不同濃度的rTg14-3-3和rTgCDPK1均可以顯著誘導Ana-1細胞發(fā)生早期凋亡和晚期凋亡;rTgEF-1α對細胞凋亡沒有明顯影響。高濃度的rTgESA10和不同濃度的rTgEF-1α、rTg14-3-3和rTgCDPK1作用Ana-1巨噬細胞后,均促進了細胞因子TNF-α、IL-1β、TGF-β1和IL-10的分泌。除個別劑量組外,四種重組蛋白均能活化Ana-1細胞表面的TLR2,rTgESA10和rTgEF-1α均能活化Ana-1細胞表面的TLR4。結(jié)果表明,四種弓形蟲重組蛋白rTgESA10、rTgEF-1α、rTg14-3-3和rTgCDPK1在體外均可顯著調(diào)節(jié)Ana-1細胞的免疫功能。
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【學位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S858.31

【參考文獻】

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1 焦玉萌;方強;夏惠;王雪梅;陶志勇;陳興智;沈繼龍;;弓形蟲ESA誘導小鼠產(chǎn)生的CD8~+ T細胞對早期黑色素瘤生長的影響[J];中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志;2013年02期

2 黃開順;黃天利;葛璞;葉彬;;剛地弓形蟲培養(yǎng)上清對人肝癌細胞HepG2增殖及凋亡的作用[J];激光雜志;2013年01期

3 Hassan Ibrahim Adam;;Isolation and Molecular Characterization of Toxoplasma gondii from Chickens in China[J];Journal of Integrative Agriculture;2012年08期

4 蘆峗;張燕麗;曹麗艷;王艷華;茍惠天;付寶權(quán);李文卉;張德林;;山羊免疫弓形蟲代謝分泌抗原后的免疫應答[J];中國獸醫(yī)學報;2012年01期

5 Yan-Bo Zeng;Shun-Hai Zhu;Hui Dong;Hong-Yu Han;Lian-Lian Jiang;Quan Wang;Jun Cheng;Qi-Ping Zhao;Wei-Jiao Ma;Bing Huang;;Great efficacy of sulfachloropyrazine-sodium against acute murine toxoplasmosis[J];Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine;2012年01期

6 李發(fā)新;李春秀;王淑芳;張德林;杜重波;馬軍武;李惠萍;;弓形蟲代謝分泌抗原疫苗對山羊流產(chǎn)高發(fā)區(qū)的免疫效果試驗[J];畜牧獸醫(yī)雜志;2012年01期

7 余建國;何忠平;;實驗動物弓形蟲免疫膠體金快速檢測方法的建立及試紙制備[J];福建畜牧獸醫(yī);2011年03期

8 高劍;葉彬;武衛(wèi)華;;剛地弓形蟲細胞培養(yǎng)上清對人結(jié)腸癌細胞sw480增殖與凋亡的影響[J];中國人獸共患病學報;2010年03期

9 葛璞;李春莉;冉亞林;葉彬;;剛地弓形蟲培養(yǎng)上清抑制肺癌A549細胞系增殖[J];基礎醫(yī)學與臨床;2010年02期

10 蔡志杰;王艷華;付寶權(quán);李文卉;蘆峗;張燕麗;曹麗艷;張德林;;弓形蟲代謝分泌抗原對豬T細胞亞群的影響[J];中國獸醫(yī)科學;2009年09期

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本文編號：2427245