發(fā)布時間：2019-02-20 20:04

【摘要】：犬子宮蓄膿(canine pyometra)是母犬發(fā)情后期發(fā)病率最高的產(chǎn)科疾病。已有研究表明,子宮內(nèi)膜囊性增生(CEH)是本病的原發(fā)性疾病,在細菌感染和其它因素的共同作用下,最終發(fā)展為犬子宮蓄膿。在犬子宮內(nèi)膜的病理變化中,雌激素(E2)和孕酮(P4)是誘發(fā)囊性增生的主要因素。本研究的主要目的是建立一個犬子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞的培養(yǎng)模型,探討孕酮受體(PR)在犬子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞中的表達,并測定E2和P4對細胞增殖和PR表達的影響,以期有助于闡明E2和P4與犬子宮蓄膿發(fā)病機理的關(guān)系,為研究犬子宮蓄膿病的病因提供依據(jù)。1.選用酶消化法分離犬子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞(ESCs),經(jīng)過原代培養(yǎng)、細胞鑒定、傳代培養(yǎng)、消化方式的探索、血清依賴性的探索,觀察犬ESCs體外培養(yǎng)的生長特性,探索該細胞的分離和培養(yǎng)的最佳方法。結(jié)果表明:37℃條件下,0.125%的膠原酶I消化3~4 h消化效果最好,易于單個細胞易分離。高濃度(20%)胎牛血清適合犬ESCs的生長。細胞呈長梭形或多角形,細胞核呈卵圓形。接種后5~6 d可長成單層,細胞間存在重疊生長現(xiàn)象。利用免疫組織化學染色法鑒定細胞,兩種形態(tài)的細胞均表達波形蛋白,陽性率可達90%以上,角蛋白陰性,證明所得到的細胞為子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞。2.使用MTT法檢測E2和P4對犬ESCs增殖的影響。結(jié)果表明,血清饑餓1 d后,無激素刺激組的細胞從第2 d開始生長速度加快,進入對數(shù)生長期,持續(xù)時間約為5 d。第6d進入平臺期,隨后開始脫落。第7 d~8 d細胞數(shù)量減少速度較慢。血清饑餓1 d后添加不同濃度的E2(15、30、100 pg/mL)細胞生長曲線類似于對照組。血清饑餓1 d后添加不同濃度的P4(3、15、30 ng/m L)細胞生長速度增快,平臺期細胞數(shù)量增多。在細胞生長周期的三個階段(d3:指數(shù)期,d6:平臺期,d8:衰亡期),E2對ESCs的增殖無典型影響,在相同階段,ESCs的增殖對E2濃度變化(15、30、100 pg/m L)不敏感。P4(15、30 ng/m L)對ESCs的增殖有顯著的促進作用(P0.05),在同一階段,ESCs的增殖與P4濃度變化呈正相關(guān)。3.通過細胞免疫組織化學染色的方法檢測E2和P4對犬ECSs中孕酮受體表達的影響。結(jié)果顯示體外培養(yǎng)的犬ESCs對PR抗體呈強陽性,細胞核呈棕黃色,細胞質(zhì)內(nèi)基本不含受體陽性物質(zhì),說明PR主要在細胞核內(nèi)表達。對照組中PR的陽性率在整個培養(yǎng)過程中始終大于90%。培養(yǎng)液中添加E2(15、30、100 pg/mL)后PR的陽性率與對照組比沒有顯著變化。培養(yǎng)液中添加P4(3、15、30 ng/mL)后,第6 d起對ESCs中PR的陽性率有顯著的抑制作用(P0.05),低濃度P4組(3 ng/m L)抑制程度隨著作用時間延長而增強,在第8 d陽性率最低。高濃度P4組(15、30 ng/mL)陽性率第8 d與第6 d比下降不明顯。低濃度P4組(3 ng/mL)第6 d、8 d的PR陽性率均低于高濃度P4組(15、30ng/m L)。以上研究表明,P4對體外培養(yǎng)的犬ESCs的增殖有促進作用。P4對PR的表達有抑制作用,且抑制強弱與P4濃度和作用時間有關(guān)。說明P4對PR表達可以在細胞水平進行調(diào)控。E2對犬ESCs的調(diào)節(jié)作用不顯著。
[Abstract]:(canine pyometra) is the most common obstetric disease in late estrus. Studies have shown that endometrial cystic hyperplasia (CEH) is a primary disease of this disease. Estrogen (E _ 2) and progesterone (P _ 4) are the main factors inducing cystic hyperplasia in canine endometrium. The main purpose of this study was to establish a canine endometrial stromal cell culture model, to investigate the expression of progesterone receptor (PR) in canine endometrial stromal cells, and to determine the effects of E2 and P4 on cell proliferation and PR expression. It is helpful to elucidate the relationship between E _ 2 and P _ 4 and the pathogenesis of canine purulent storage, and to provide the basis for the study of the etiology of canine purulent disease. The growth characteristics of canine endometrial stromal cells (ESCs) in vitro were observed by enzyme digestion method after primary culture, cell identification, passage culture, digestion mode exploration, serum-dependent exploration, in vitro culture of canine endometrial stromal cells. To explore the best method of cell isolation and culture. The results showed that at 37 鈩，

本文編號：2427213