【摘要】：絨山羊的毛囊有初級毛囊(PHF)和次級毛囊(SHF)之分,分別決定著羊毛與羊絨的發(fā)育和再生。研究表明,絨山羊的毛囊發(fā)端于胎兒時期,主要成熟于胎兒時期,完成于青年羊階段,在整個發(fā)生發(fā)育過程中具有明顯的階段性特征。絨山羊的毛囊發(fā)生與發(fā)育涉及眾多關(guān)鍵基因,目前的主要功能基因及其互作網(wǎng)絡(luò)尚未明確。第二代高通量測序技術(shù),特別是RNA-seq技術(shù)的應(yīng)用為絨山羊毛囊發(fā)育的分子調(diào)控研究提供了可能,目前在內(nèi)蒙古白絨山羊等品種上的研究也取得了較大進展。然而,對陜北白絨山羊的毛囊發(fā)育,特別是關(guān)于毛囊發(fā)育早期的研究尚屬空白。本研究旨在研究陜北白絨山羊胎兒期和羔羊期皮膚組織形態(tài)發(fā)育規(guī)律研究的基礎(chǔ)上,重點對其胎兒期早期(E60)、中期120d(E120)和末期(NB)的皮膚毛囊進行轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究與分析,進而篩選、鑒定影響胎兒期絨山羊毛囊發(fā)育的關(guān)鍵基因,為絨山羊毛囊周期性生長調(diào)控奠定理論基礎(chǔ);另外,本試驗,試圖在基于CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建基因缺陷型毛乳頭細胞(DP)模型的基礎(chǔ)上,比較研究絨山羊毛囊關(guān)鍵調(diào)控基因,如維生素D受體基因(VDR)的功能,并試圖通過添加外源化合物,驗證關(guān)鍵基因的調(diào)控作用,為絨山羊的遺傳改良,特別是基因編輯修飾提供技術(shù)和候選基因。取得的主要研究結(jié)果如下:1.陜北白絨山羊胎兒期60胎齡(E60)、120胎齡(E120)和新生羔羊(NB)三個階段觀察分析其毛囊組織形態(tài)特征,發(fā)現(xiàn)E60時PHF的基板在頭頸和體側(cè)部已出現(xiàn),且頭頸部的基板深度均顯著大于體側(cè)部;至E120時PHF的結(jié)構(gòu)完整且毛干已經(jīng)形成,但是未長出皮膚表面。SHF大量出現(xiàn),一些SHF的完整結(jié)構(gòu)已經(jīng)形成,還有大部分SHF結(jié)構(gòu)不完整,發(fā)育不成熟;至NB時,PHF中的毛干已經(jīng)長出皮膚表面,完全發(fā)育成熟。SHF的一部分此時結(jié)構(gòu)完整,發(fā)育成熟,可是尚有大量結(jié)構(gòu)不完整的SHF。2.陜北白絨山羊0-160日齡公羔分八個階段(0,7,14,28,42,56,84,160 d)觀測毛囊組織形態(tài)特征,結(jié)果表明絨山羊的毛囊群多為三元型毛囊,即3個PHF,周圍有若干個SHF構(gòu)成一個毛囊群;0-14 d,少部分SHF結(jié)構(gòu)完整,且羊絨已經(jīng)長出體表,大多數(shù)SHF結(jié)構(gòu)還不完整;14-84 d期間,毛囊群中SHF數(shù)量快速增加,長度變長且不斷向真皮層延伸;84-160 d時絕大多數(shù)SHF的內(nèi)根鞘、外根鞘等結(jié)構(gòu)完整,羊絨完全長出體表。少數(shù)SHF的結(jié)構(gòu)完整,羊絨還未長出體表,表明尚未成熟。3.絨山羊E60、E120和NB階段,采集9個胎兒皮膚毛囊樣品(每個時期3個),成功構(gòu)建了9個總RNA文庫。經(jīng)Illumina HiSeq?2000測序,從每個文庫獲得的干凈reads2.06千萬以上。分析表明E120/E60、NB/E60、E120/NB分別有1024、1801、0個DEGs,E60、E120和NB階段總共出現(xiàn)了2059個DEGs。4.采用趨勢分析方法,對上述2059個degs表達軌跡的聚類分析,這些degs聚集在8條表達軌跡上,其中1975個degs主要聚集在4條表達軌跡上,且可能與毛囊發(fā)育有關(guān)。進一步的go富集分析表明,上述2059個degs顯著富集在細胞位置、分子功能和生物過程等類別(p0.05),且生物過程中屬于單組織過程的有80.6%degs,單組織細胞過程的有69.3%degs、生物調(diào)節(jié)的有48.1%degs。kegg的分析表明55.5%的degs參與了218條信號通路,且主要是富集在癌癥通路和ecm-受體相互作用信號通路上。5.采用差異基因表達軌跡分析方法與kegg分析方法綜合分析,發(fā)現(xiàn)主要聚集在4條轉(zhuǎn)錄軌跡上的1975個degs中有10個degs被注釋在ecm及其受體相互作用信號通路上,且其在e60時的基因表達量顯著高于e120和nb時(p㩳0.05),說明這10個degs與毛囊發(fā)生有關(guān)。有10個degs被注釋到癌癥通路上,且其他通路上存在7個很重要的轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因。這些degs在e120、nb時的基因表達量顯著高于e60時(p㩳0.05),表明這17個degs可能與毛囊發(fā)育和成熟有關(guān);同時發(fā)現(xiàn),vdr基因明顯與發(fā)育過程、角質(zhì)形成細胞的增殖分化有關(guān),而且vdr基因在e120和nb時的表達量極顯著上調(diào)(p㩳0.001)。6.首次克隆陜北白絨山羊vdr基因完整的cds區(qū)序列。基于此,采用實時定量pcr技術(shù)對vdr基因在絨山羊胎兒期的表達情況進行了研究,結(jié)果表明e60和e120時在9個絨山羊組織中vdrmrna的表達差異較大,且以e120時的皮膚組織中vdr基因的表達量最高;免疫組化研究結(jié)果表明,在e120和nb時vdr蛋白在毛囊內(nèi)根鞘、外根鞘和毛球部高表達。7.基于crispr/cas9技術(shù)成功構(gòu)建了vdr缺陷型毛乳頭(dp)細胞模型,與野生型dp細胞相比,純合突變細胞cell-4中vdr基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低77%,vdr蛋白水平顯著降低69.5%(p㩳0.05)。在此基礎(chǔ)上,通過比較vdr缺陷型dp細胞與野生型dp細胞的培養(yǎng)情況,缺失vdr基因cds區(qū)之后,dp細胞增殖速度明顯降低(p㩳0.05),而且igf-1、noggin、lef1和b-catenin等4個基因的mrna表達水平顯著下調(diào)(p㩳0.05),說明vdr基因的缺失可能會抑制wnt、bmp和igf-1信號通路,進而影響毛囊的發(fā)育;8.野生型dp細胞中添加外源化合物,發(fā)現(xiàn)不同濃度的cm(姜黃素)和aa(花生四烯酸)可顯著促進dp細胞的增殖(p㩳0.05),顯著提高vdr基因的mrna和蛋白表達;顯著提高igf1、noggin、b-catenin和lef1基因的mrna表達(p㩳0.05);同時,在vdr基因缺陷型dp細胞上發(fā)現(xiàn)具有類似結(jié)果,可是,當(dāng)添加aa時,igf1基因的mrna表達沒有顯著變化,說明aa對于毛囊中igf-1表達的促進作用受到vdr基因的調(diào)控。綜上所述,陜北白絨山羊在胎兒期發(fā)育至60天時已形成了phf基板,羔羊出生時(nb)phf已經(jīng)完全成熟,可是,羔羊生后160日齡時shf尚未完全成熟;rna-seq轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明,絨山羊胎兒期VDR基因?qū)γ野l(fā)育成熟有重要作用;進一步的分析表明VDR基因?qū)γ业腄P細胞具有調(diào)控作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S827

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