發(fā)布時(shí)間：2019-02-16 00:28

【摘要】：絨山羊的毛囊有初級(jí)毛囊(PHF)和次級(jí)毛囊(SHF)之分,分別決定著羊毛與羊絨的發(fā)育和再生。研究表明,絨山羊的毛囊發(fā)端于胎兒時(shí)期,主要成熟于胎兒時(shí)期,完成于青年羊階段,在整個(gè)發(fā)生發(fā)育過(guò)程中具有明顯的階段性特征。絨山羊的毛囊發(fā)生與發(fā)育涉及眾多關(guān)鍵基因,目前的主要功能基因及其互作網(wǎng)絡(luò)尚未明確。第二代高通量測(cè)序技術(shù),特別是RNA-seq技術(shù)的應(yīng)用為絨山羊毛囊發(fā)育的分子調(diào)控研究提供了可能,目前在內(nèi)蒙古白絨山羊等品種上的研究也取得了較大進(jìn)展。然而,對(duì)陜北白絨山羊的毛囊發(fā)育,特別是關(guān)于毛囊發(fā)育早期的研究尚屬空白。本研究旨在研究陜北白絨山羊胎兒期和羔羊期皮膚組織形態(tài)發(fā)育規(guī)律研究的基礎(chǔ)上,重點(diǎn)對(duì)其胎兒期早期(E60)、中期120d(E120)和末期(NB)的皮膚毛囊進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究與分析,進(jìn)而篩選、鑒定影響胎兒期絨山羊毛囊發(fā)育的關(guān)鍵基因,為絨山羊毛囊周期性生長(zhǎng)調(diào)控奠定理論基礎(chǔ);另外,本試驗(yàn),試圖在基于CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建基因缺陷型毛乳頭細(xì)胞(DP)模型的基礎(chǔ)上,比較研究絨山羊毛囊關(guān)鍵調(diào)控基因,如維生素D受體基因(VDR)的功能,并試圖通過(guò)添加外源化合物,驗(yàn)證關(guān)鍵基因的調(diào)控作用,為絨山羊的遺傳改良,特別是基因編輯修飾提供技術(shù)和候選基因。取得的主要研究結(jié)果如下:1.陜北白絨山羊胎兒期60胎齡(E60)、120胎齡(E120)和新生羔羊(NB)三個(gè)階段觀察分析其毛囊組織形態(tài)特征,發(fā)現(xiàn)E60時(shí)PHF的基板在頭頸和體側(cè)部已出現(xiàn),且頭頸部的基板深度均顯著大于體側(cè)部;至E120時(shí)PHF的結(jié)構(gòu)完整且毛干已經(jīng)形成,但是未長(zhǎng)出皮膚表面。SHF大量出現(xiàn),一些SHF的完整結(jié)構(gòu)已經(jīng)形成,還有大部分SHF結(jié)構(gòu)不完整,發(fā)育不成熟;至NB時(shí),PHF中的毛干已經(jīng)長(zhǎng)出皮膚表面,完全發(fā)育成熟。SHF的一部分此時(shí)結(jié)構(gòu)完整,發(fā)育成熟,可是尚有大量結(jié)構(gòu)不完整的SHF。2.陜北白絨山羊0-160日齡公羔分八個(gè)階段(0,7,14,28,42,56,84,160 d)觀測(cè)毛囊組織形態(tài)特征,結(jié)果表明絨山羊的毛囊群多為三元型毛囊,即3個(gè)PHF,周圍有若干個(gè)SHF構(gòu)成一個(gè)毛囊群;0-14 d,少部分SHF結(jié)構(gòu)完整,且羊絨已經(jīng)長(zhǎng)出體表,大多數(shù)SHF結(jié)構(gòu)還不完整;14-84 d期間,毛囊群中SHF數(shù)量快速增加,長(zhǎng)度變長(zhǎng)且不斷向真皮層延伸;84-160 d時(shí)絕大多數(shù)SHF的內(nèi)根鞘、外根鞘等結(jié)構(gòu)完整,羊絨完全長(zhǎng)出體表。少數(shù)SHF的結(jié)構(gòu)完整,羊絨還未長(zhǎng)出體表,表明尚未成熟。3.絨山羊E60、E120和NB階段,采集9個(gè)胎兒皮膚毛囊樣品(每個(gè)時(shí)期3個(gè)),成功構(gòu)建了9個(gè)總RNA文庫(kù)。經(jīng)Illumina HiSeq?2000測(cè)序,從每個(gè)文庫(kù)獲得的干凈reads2.06千萬(wàn)以上。分析表明E120/E60、NB/E60、E120/NB分別有1024、1801、0個(gè)DEGs,E60、E120和NB階段總共出現(xiàn)了2059個(gè)DEGs。4.采用趨勢(shì)分析方法,對(duì)上述2059個(gè)degs表達(dá)軌跡的聚類分析,這些degs聚集在8條表達(dá)軌跡上,其中1975個(gè)degs主要聚集在4條表達(dá)軌跡上,且可能與毛囊發(fā)育有關(guān)。進(jìn)一步的go富集分析表明,上述2059個(gè)degs顯著富集在細(xì)胞位置、分子功能和生物過(guò)程等類別(p0.05),且生物過(guò)程中屬于單組織過(guò)程的有80.6%degs,單組織細(xì)胞過(guò)程的有69.3%degs、生物調(diào)節(jié)的有48.1%degs。kegg的分析表明55.5%的degs參與了218條信號(hào)通路,且主要是富集在癌癥通路和ecm-受體相互作用信號(hào)通路上。5.采用差異基因表達(dá)軌跡分析方法與kegg分析方法綜合分析,發(fā)現(xiàn)主要聚集在4條轉(zhuǎn)錄軌跡上的1975個(gè)degs中有10個(gè)degs被注釋在ecm及其受體相互作用信號(hào)通路上,且其在e60時(shí)的基因表達(dá)量顯著高于e120和nb時(shí)(p㩳0.05),說(shuō)明這10個(gè)degs與毛囊發(fā)生有關(guān)。有10個(gè)degs被注釋到癌癥通路上,且其他通路上存在7個(gè)很重要的轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因。這些degs在e120、nb時(shí)的基因表達(dá)量顯著高于e60時(shí)(p㩳0.05),表明這17個(gè)degs可能與毛囊發(fā)育和成熟有關(guān);同時(shí)發(fā)現(xiàn),vdr基因明顯與發(fā)育過(guò)程、角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖分化有關(guān),而且vdr基因在e120和nb時(shí)的表達(dá)量極顯著上調(diào)(p㩳0.001)。6.首次克隆陜北白絨山羊vdr基因完整的cds區(qū)序列�；诖�,采用實(shí)時(shí)定量pcr技術(shù)對(duì)vdr基因在絨山羊胎兒期的表達(dá)情況進(jìn)行了研究,結(jié)果表明e60和e120時(shí)在9個(gè)絨山羊組織中vdrmrna的表達(dá)差異較大,且以e120時(shí)的皮膚組織中vdr基因的表達(dá)量最高;免疫組化研究結(jié)果表明,在e120和nb時(shí)vdr蛋白在毛囊內(nèi)根鞘、外根鞘和毛球部高表達(dá)。7.基于crispr/cas9技術(shù)成功構(gòu)建了vdr缺陷型毛乳頭(dp)細(xì)胞模型,與野生型dp細(xì)胞相比,純合突變細(xì)胞cell-4中vdr基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低77%,vdr蛋白水平顯著降低69.5%(p㩳0.05)。在此基礎(chǔ)上,通過(guò)比較vdr缺陷型dp細(xì)胞與野生型dp細(xì)胞的培養(yǎng)情況,缺失vdr基因cds區(qū)之后,dp細(xì)胞增殖速度明顯降低(p㩳0.05),而且igf-1、noggin、lef1和b-catenin等4個(gè)基因的mrna表達(dá)水平顯著下調(diào)(p㩳0.05),說(shuō)明vdr基因的缺失可能會(huì)抑制wnt、bmp和igf-1信號(hào)通路,進(jìn)而影響毛囊的發(fā)育;8.野生型dp細(xì)胞中添加外源化合物,發(fā)現(xiàn)不同濃度的cm(姜黃素)和aa(花生四烯酸)可顯著促進(jìn)dp細(xì)胞的增殖(p㩳0.05),顯著提高vdr基因的mrna和蛋白表達(dá);顯著提高igf1、noggin、b-catenin和lef1基因的mrna表達(dá)(p㩳0.05);同時(shí),在vdr基因缺陷型dp細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)具有類似結(jié)果,可是,當(dāng)添加aa時(shí),igf1基因的mrna表達(dá)沒(méi)有顯著變化,說(shuō)明aa對(duì)于毛囊中igf-1表達(dá)的促進(jìn)作用受到vdr基因的調(diào)控。綜上所述,陜北白絨山羊在胎兒期發(fā)育至60天時(shí)已形成了phf基板,羔羊出生時(shí)(nb)phf已經(jīng)完全成熟,可是,羔羊生后160日齡時(shí)shf尚未完全成熟;rna-seq轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明,絨山羊胎兒期VDR基因?qū)γ野l(fā)育成熟有重要作用;進(jìn)一步的分析表明VDR基因?qū)γ业腄P細(xì)胞具有調(diào)控作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S827

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本文編號(hào)：2423853