【摘要】：玉米赤霉烯酮(ZEA)是由鐮刀菌等真菌產(chǎn)生的一種霉菌毒素,廣泛存在于動物飼料和人類的食品中。研究表明,ZEA具有生殖發(fā)育毒性、遺傳毒性、免疫毒性、致癌性。ZEA可以導致雄性動物的雄激素分泌下降,雄性動物雌性化和性欲降低,以及影響精子的生長發(fā)育,而睪丸支持細胞在生殖和精子發(fā)生過程中發(fā)揮著關鍵作用。但是到目前為止,人們對ZEA的雄性生殖毒性仍缺乏全面的認識,尤其是對ZEA的雄性生殖毒性的分子機理知之甚少。鑒于此,本研究通過建立ZEA與睪丸支持細胞體外模型,檢測ZEA對支持細胞骨架結構和功能蛋白分泌的影響,從分子水平上探討ZEA對睪丸支持細胞的毒性機理。本試驗以原代睪丸支持細胞為對象,通過胰酶和膠原酶的消化分離支持細胞,利用臺盼藍,油紅O以及FSHR免疫熒光對分離的細胞進行活率和純度鑒定。本試驗通過MTT法確定了ZEA的染毒濃度及染毒時間；通過激光共聚焦顯微鏡檢測ZEA對支持細胞骨架蛋白α-tubulin, F-actin和細胞核的形態(tài)結構影響,利用透射電子顯微鏡觀擦ZEA對支持細胞線粒體,內(nèi)質(zhì)網(wǎng),高爾基體等超微結構的影響；利用QRT-PCR、 Wester-blot、 ELISA等實驗技術檢測ZEA對支持細胞ABP、Inhibin-β、FSHR、Vimentin、Transferrin和N-cadherin等功能蛋白分泌的影響。1.睪丸支持細胞的分離培養(yǎng)及鑒定。采用胰蛋白酶和膠原酶對睪丸組織進行二步消化,可以有效地分離到支持細胞,通過臺盼藍染法測定細胞獲得的大鼠睪丸支持細胞活率在95%以上；利用油紅O染色法和FSHR免疫熒光法對分離的睪丸支持細胞進行純度鑒定,獲得的大鼠睪丸支持細胞純度在95%以上。2.ZEA對睪丸支持細胞骨架及超微結構的影響。MTT法確定本試驗的ZEA染毒濃度為0 μg/mL、5 μg/mL、10μg/mL，，20μg/mL,染毒時間為24h；激光共聚焦顯微鏡觀察顯示,隨著ZEA染毒濃度的升高,支持細胞α-tubulin 和 F-actin等骨架蛋白和細胞核的損傷程度加大,染毒組細胞核呈新月狀,形式凹陷,嚴重可見核碎裂；透視電鏡觀察顯示,ZEA可以破壞支持細胞的內(nèi)部結構,包括線粒體出現(xiàn)脊脫落甚至消失、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)模糊、水腫和斷裂、細胞質(zhì)內(nèi)的空泡及脂肪滴破損。3.ZEA對睪丸支持細胞功能蛋白分泌的影響。QRT-PCR檢測結果顯示,FSH IR的染毒組與對照組mRNA相比表達并沒有明顯的變化,而ABP、Vimentin、 N-cadherin的mRNA表達與對照組相比都有不同程度的下降,其中ABP在10、20 μg/mL下降顯著(P0.05), Vimentin 和 N-cadherin在20μg/mL染毒組下降顯著(P0.05),相反,Transferrin的 mRNA表達隨著ZEA染毒濃度的增加,與對照組相比均有顯著性差異(P0.01；P0.05)。Wester-blot結果顯示,與對照組相比,染毒組的ABP、FSHR、Vimentin、Transferrin、 N-cadherin蛋白表達均呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(P0.01;P0.05)。ELISA結果顯示,與對照組相比,染毒組Inhibin-β和Transferrin的濃度都有有不同程度的下降,其中Inhibin-P在10和20μg/mL染毒組下降顯著(P0.05),而Transferrin在20μg/mL染毒組下降顯著(P0.05)。結論認為,ZEA的雄性動物生殖毒性可能與其對支持細胞骨架的破壞進而影響了血睪屏障有關。ZEA可以影響支持細胞ABP、FSHR、Transferrin、Inhibin-β等功能蛋白的分泌,這些功能性蛋白表達的異常將直接影響到精子發(fā)育的調(diào)節(jié)和營養(yǎng)的供給。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S859.8

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