【摘要】：玉米赤霉烯酮(ZEA)是由鐮刀菌等真菌產(chǎn)生的一種霉菌毒素,廣泛存在于動(dòng)物飼料和人類的食品中。研究表明,ZEA具有生殖發(fā)育毒性、遺傳毒性、免疫毒性、致癌性。ZEA可以導(dǎo)致雄性動(dòng)物的雄激素分泌下降,雄性動(dòng)物雌性化和性欲降低,以及影響精子的生長發(fā)育,而睪丸支持細(xì)胞在生殖和精子發(fā)生過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。但是到目前為止,人們對ZEA的雄性生殖毒性仍缺乏全面的認(rèn)識(shí),尤其是對ZEA的雄性生殖毒性的分子機(jī)理知之甚少。鑒于此,本研究通過建立ZEA與睪丸支持細(xì)胞體外模型,檢測ZEA對支持細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和功能蛋白分泌的影響,從分子水平上探討ZEA對睪丸支持細(xì)胞的毒性機(jī)理。本試驗(yàn)以原代睪丸支持細(xì)胞為對象,通過胰酶和膠原酶的消化分離支持細(xì)胞,利用臺(tái)盼藍(lán),油紅O以及FSHR免疫熒光對分離的細(xì)胞進(jìn)行活率和純度鑒定。本試驗(yàn)通過MTT法確定了ZEA的染毒濃度及染毒時(shí)間；通過激光共聚焦顯微鏡檢測ZEA對支持細(xì)胞骨架蛋白α-tubulin, F-actin和細(xì)胞核的形態(tài)結(jié)構(gòu)影響,利用透射電子顯微鏡觀擦ZEA對支持細(xì)胞線粒體,內(nèi)質(zhì)網(wǎng),高爾基體等超微結(jié)構(gòu)的影響；利用QRT-PCR、 Wester-blot、 ELISA等實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測ZEA對支持細(xì)胞ABP、Inhibin-β、FSHR、Vimentin、Transferrin和N-cadherin等功能蛋白分泌的影響。1.睪丸支持細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定。采用胰蛋白酶和膠原酶對睪丸組織進(jìn)行二步消化,可以有效地分離到支持細(xì)胞,通過臺(tái)盼藍(lán)染法測定細(xì)胞獲得的大鼠睪丸支持細(xì)胞活率在95%以上；利用油紅O染色法和FSHR免疫熒光法對分離的睪丸支持細(xì)胞進(jìn)行純度鑒定,獲得的大鼠睪丸支持細(xì)胞純度在95%以上。2.ZEA對睪丸支持細(xì)胞骨架及超微結(jié)構(gòu)的影響。MTT法確定本試驗(yàn)的ZEA染毒濃度為0 μg/mL、5 μg/mL、10μg/mL，，20μg/mL,染毒時(shí)間為24h；激光共聚焦顯微鏡觀察顯示,隨著ZEA染毒濃度的升高,支持細(xì)胞α-tubulin 和 F-actin等骨架蛋白和細(xì)胞核的損傷程度加大,染毒組細(xì)胞核呈新月狀,形式凹陷,嚴(yán)重可見核碎裂；透視電鏡觀察顯示,ZEA可以破壞支持細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu),包括線粒體出現(xiàn)脊脫落甚至消失、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)模糊、水腫和斷裂、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的空泡及脂肪滴破損。3.ZEA對睪丸支持細(xì)胞功能蛋白分泌的影響。QRT-PCR檢測結(jié)果顯示,FSH IR的染毒組與對照組mRNA相比表達(dá)并沒有明顯的變化,而ABP、Vimentin、 N-cadherin的mRNA表達(dá)與對照組相比都有不同程度的下降,其中ABP在10、20 μg/mL下降顯著(P0.05), Vimentin 和 N-cadherin在20μg/mL染毒組下降顯著(P0.05),相反,Transferrin的 mRNA表達(dá)隨著ZEA染毒濃度的增加,與對照組相比均有顯著性差異(P0.01；P0.05)。Wester-blot結(jié)果顯示,與對照組相比,染毒組的ABP、FSHR、Vimentin、Transferrin、 N-cadherin蛋白表達(dá)均呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(P0.01;P0.05)。ELISA結(jié)果顯示,與對照組相比,染毒組Inhibin-β和Transferrin的濃度都有有不同程度的下降,其中Inhibin-P在10和20μg/mL染毒組下降顯著(P0.05),而Transferrin在20μg/mL染毒組下降顯著(P0.05)。結(jié)論認(rèn)為,ZEA的雄性動(dòng)物生殖毒性可能與其對支持細(xì)胞骨架的破壞進(jìn)而影響了血睪屏障有關(guān)。ZEA可以影響支持細(xì)胞ABP、FSHR、Transferrin、Inhibin-β等功能蛋白的分泌,這些功能性蛋白表達(dá)的異常將直接影響到精子發(fā)育的調(diào)節(jié)和營養(yǎng)的供給。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S859.8

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