【摘要】：小反芻獸疫(Peste des Petits Ruminants,PPR),是由麻疹病毒屬的小反芻獸疫病毒(Peste des Petits Ruminants Virus,PPRV)感染引起的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病。該病是OIE規(guī)定的A類疫病,我國(guó)規(guī)定的一類動(dòng)物疫病。H蛋白是PPRV的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一,具有血凝素和神經(jīng)氨酸酶活性,可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,是疫苗和診斷試劑研發(fā)的重要靶標(biāo)。本研究制備了PPRV H蛋白的單克隆抗體,構(gòu)建了表達(dá)H蛋白的重組桿狀病毒,并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)其免疫原性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià),為建立PPRV的檢測(cè)方法和新型疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。具體研究?jī)?nèi)容如下:1.PPRV H蛋白單克隆抗體的制備及鑒定將PPRV H基因克隆至原核表達(dá)載體pGEX-KG中,通過(guò)摸索蛋白最優(yōu)表達(dá)條件獲得純化蛋白pGEX-KG-PPRV-H,將此蛋白免疫BALB/c小鼠,通過(guò)細(xì)胞融合和間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)及亞克隆技術(shù),篩選雜交瘤細(xì)胞株,得到4株可穩(wěn)定分泌抗PPRV H蛋白的特異性單克隆抗體,分別命名為:1C4、1D8、2A1和2E1。經(jīng)鑒定,IgG亞型均為IgG1,輕鏈均為Kappa鏈。通過(guò)間接免疫熒光和Western Blot分析,證實(shí)了獲得的4株單抗均具有較好的特異性。2.PPRV H蛋白在桿狀病毒中的表達(dá)及其免疫原性初步研究將PPRV H基因克隆至供體質(zhì)粒Pfast Bac HTB中,將此重組供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DH10bac,經(jīng)PCR驗(yàn)證,得到重組bacmid-PPRV-H。將重組bacmid-PPRV-H轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞,成功拯救出重組桿狀病毒Bacmid-PPRV-H。通過(guò)間接免疫熒光和Western Blot分析,PPRV H蛋白在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)。將該重組蛋白免疫BALB/c小鼠,結(jié)果表明,Bacmid-PPRV-H蛋白可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)PPRV的特異性中和抗體。
[Abstract]:Small ruminant disease (Peste des Petits Ruminants,PPR) is an acute, acute and highly contagious disease caused by (Peste des Petits Ruminants Virus,PPRV of measles virus. H protein is one of the main structural proteins of PPRV and has the activities of hemagglutinin and neuraminidase, which can induce the body to produce neutralizing antibodies. It is an important target for research and development of vaccines and diagnostic reagents. In this study, monoclonal antibodies against PPRV H protein were prepared, recombinant baculovirus expressing H protein was constructed, and its immunogenicity was preliminarily evaluated through animal experiments, which laid a foundation for the establishment of detection methods for PPRV and the study of novel vaccines. The specific research contents are as follows: preparation and identification of monoclonal antibody against 1.PPRV H protein. The PPRV H gene was cloned into prokaryotic expression vector pGEX-KG, and purified protein pGEX-KG-PPRV-H, was obtained by exploring the optimal expression conditions of the protein. BALB/c mice were immunized with this protein. The hybridoma cell lines were screened by cell fusion, indirect enzyme-linked immunosorbent assay (Elisa) and subcloning techniques. The specific monoclonal antibodies against PPRV H protein could be secreted stably by four hybridoma cell lines. They were named as: 1C4D8A1and 2E1. The subtypes of IgG were identified as IgG1, light chain and Kappa chain. The expression of 2.PPRV H protein in baculovirus and its immunogenicity were confirmed by indirect immunofluorescence and Western Blot analysis. PPRV H gene was cloned into donor plasmid Pfast Bac HTB. The recombinant donor plasmid was transfected into DH10bac, and the recombinant bacmid-PPRV-H. was obtained by PCR validation. Recombinant bacmid-PPRV-H was transfected into sf9 cells, and recombinant baculovirus Bacmid-PPRV-H. was successfully saved. , PPRV H protein was successfully expressed in baculovirus expression system by indirect immunofluorescence and Western Blot analysis. The recombinant protein was used to immunize BALB/c mice. The results showed that Bacmid-PPRV-H protein could induce the production of specific neutralizing antibodies against PPRV in mice.
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：2412952