發(fā)布時間：2019-01-19 10:03

【摘要】：傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease, IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)引起的雛雞急性、高度接觸性疾病。IBDV的感染對雛雞的法氏囊造成損傷,從而導(dǎo)致免疫抑制,增加了機(jī)體對其他疾病的易感性。為了克服弱毒活疫苗和中等毒力活疫苗的缺陷,本研究通過在火雞皰疹病毒(HVT) FC126毒株的US2復(fù)制非必需區(qū),插入IBDV超強(qiáng)毒株的VP2基因,構(gòu)建表達(dá)VP2蛋白的重組HVT疫苗毒株,旨在為研制預(yù)防IBD和馬立克氏病(MD)的二聯(lián)基因工程疫苗打下基礎(chǔ)。本研究以IBDV XD2010超強(qiáng)毒株為模板,通過RT-PCR擴(kuò)增其VP2基因,利用HVTFC126疫苗株基因組US2同源序列、CMV啟動子和綠色熒光蛋白(EGFP)基因,構(gòu)建含有VP2基因的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pCMV-EGFP-VP2,以磷酸鈣沉淀法將轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒和HVTFC126基因組DNA共同轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞(CEF),通過篩選、純化得到帶EGFP標(biāo)志的重組病毒rHVT-EGFP-VP2。利用Cre重組酶去除rHVT-EGFP-VP2基因組中的EGFP基因,重新轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞,經(jīng)篩選、純化得到不含EGFP基因的重組病毒rHVT-VP2。經(jīng)PCR、間接免疫熒光(IFA)和western blot鑒定,重組病毒rHVT-VP2可正確表達(dá)VP2蛋白。在重組病毒rHVT-VP2對IBDV超強(qiáng)毒株的免疫保護(hù)試驗(yàn)中,設(shè)立rHVT-VP2疫苗組、中等毒力疫苗組(N87)、空白對照組和攻毒對照組,從各試驗(yàn)組免疫后的法氏囊重量／體重(囊體比)的變化、發(fā)病率、死亡率、攻毒后的增重、抗體水平等方面進(jìn)行免疫保護(hù)效力的評價。結(jié)果發(fā)現(xiàn),rHVT-VP2組免疫后法氏囊正常,而N87疫苗組免疫后法氏囊發(fā)生了萎縮；rHVT-VP2組及N87疫苗組攻毒后的發(fā)病率、死亡率與攻毒對照組相比差異極顯著；攻毒后rHVT-VP2組體重增重顯著高于N87疫苗組；利用本研究所建立的間接ELISA方法檢測IBDV抗體,發(fā)現(xiàn)rHVT-VP2能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高水平的特異性抗體,并在一定時間內(nèi)持續(xù)升高,抗體水平明顯高于N87疫苗組；結(jié)合各組臨床癥狀及器官病理變化,得出結(jié)論：重組病毒rHVT-VP2有效抵抗IBDV超強(qiáng)毒株的攻擊,且免疫保護(hù)效力高于‘N87疫苗組。重組病毒rHVT-VP2對MDV的免疫保護(hù)試驗(yàn)中,rHVT-VP2組對MD保護(hù)率和HVTFC126疫苗組保護(hù)率相當(dāng),證明重組病毒rHVT-VP2能使機(jī)體產(chǎn)生較高的免疫保護(hù)力,足以抵抗MDV RB1B強(qiáng)毒株的攻擊。綜上所述,本試驗(yàn)所構(gòu)建的重組病毒rHVT-VP2有效抵抗IBDV超強(qiáng)毒株攻擊的同時,又能刺激機(jī)體對MDV的侵襲產(chǎn)生較高的免疫保護(hù)力,是理想的能夠同時抵抗IBDV超強(qiáng)毒株及MDV攻擊的新型疫苗。
[Abstract]:Infectious bursal disease (Infectious bursal disease, IBD) is an acute and highly contact disease in chicks caused by infectious bursal disease virus (Infectious bursal disease virus, IBDV). The infection of IBDV causes damage to the bursa of Fabricius, which leads to immunosuppression. Increases the body's susceptibility to other diseases. In order to overcome the defects of live attenuated vaccine and moderately virulent live vaccine, the recombinant HVT vaccine strain expressing VP2 protein was constructed by inserting the VP2 gene of IBDV supervirulent strain into the non-essential region of US2 replication of turkey herpesvirus (HVT) FC126 strain. The aim is to lay a foundation for the development of dual genetic engineering vaccine for the prevention of IBD and Marek's disease (MD). In this study, the VP2 gene was amplified by RT-PCR using IBDV XD2010 supervirulent strain as a template. The genomic US2 homologous sequence of HVTFC126 vaccine strain, CMV promoter and green fluorescent protein (EGFP) gene were used. The transfer vector pCMV-EGFP-VP2, containing VP2 gene was constructed. The transfer vector plasmid and HVTFC126 genomic DNA were co-transfected into chicken embryo fibroblast (CEF), by calcium phosphate precipitation. Purification of Recombinant virus rHVT-EGFP-VP2. with EGFP Marker Cre recombinant enzyme was used to remove the EGFP gene from the rHVT-EGFP-VP2 genome, and then was retransfected into CEF cells. After screening, the recombinant virus rHVT-VP2. with no EGFP gene was purified. By PCR, indirect immunofluorescence (IFA) and western blot identification, the recombinant virus rHVT-VP2 can express VP2 protein correctly. In the immunoprotection test of recombinant virus rHVT-VP2 against IBDV supervirulent strain, rHVT-VP2 vaccine group, moderate virulence vaccine group (N87), blank control group and attack control group were established. The immune protection effectiveness was evaluated from the changes of bursa weight / body weight (thylakoid ratio), morbidity, mortality, weight gain after attack and antibody level. The results showed that the bursa of Fabricius was normal after immunization in rHVT-VP2 group, but shrank after immunization in N87 vaccine group, the morbidity and mortality of rHVT-VP2 group and N87 vaccine group were significantly different from those of control group. The weight gain of rHVT-VP2 group was significantly higher than that of N87 vaccine group. Using the indirect ELISA method established in this study to detect IBDV antibody, it was found that rHVT-VP2 could induce the body to produce a higher level of specific antibody, and the antibody level was significantly higher than that of N87 vaccine group. Combined with the clinical symptoms and pathological changes of organs in each group, it was concluded that the recombinant virus rHVT-VP2 could effectively resist the attack of IBDV super virulent strain, and the immune protection effect was higher than that of 'N87 vaccine group. In the immunoprotection test of recombinant virus rHVT-VP2 to MDV, the protective rate of rHVT-VP2 group to MD was similar to that of HVTFC126 vaccine group, which proved that the recombinant virus rHVT-VP2 could make the body produce higher immune protection ability, which could resist the attack of MDV RB1B virulent strain. In conclusion, the recombinant virus rHVT-VP2 constructed in this study can not only effectively resist the attack of IBDV super virulent strain, but also stimulate the body to produce higher immune protection against the invasion of MDV. It is an ideal new vaccine that can resist both IBDV super virulent strain and MDV attack.
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.4

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本文編號：2411264