【摘要】：大豆凝集素(SBA)是大豆及大豆產(chǎn)品中含有的抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì),這種物質(zhì)可通過與腸道上皮細(xì)胞膜表面特異性結(jié)合,改變細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及功能,影響腸上皮細(xì)胞的代謝過程。整聯(lián)蛋白是細(xì)胞膜上的跨膜糖蛋白,其介導(dǎo)的細(xì)胞粘附作用是指導(dǎo)細(xì)胞生物學(xué)功能的一個重要因素。為了闡明SBA在影響豬腸道上皮細(xì)胞健康過程中是否與整聯(lián)蛋白的信號傳遞存在關(guān)系,本論文主要開展了以下三部分試驗研究。本研究以仔豬小腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2)為細(xì)胞模型,探究表達(dá)于IPEC-J2細(xì)胞中整聯(lián)蛋白亞基的種類,探索這些整聯(lián)蛋白亞基的在IPEC-J2細(xì)胞增殖,周期,凋亡以及SBA引起的IPEC-J2細(xì)胞周期及凋亡改變中的作用,初步研究SBA與這些整聯(lián)蛋白之間的作用關(guān)系及連接方式,為揭示SBA的抗?fàn)I養(yǎng)機(jī)制提供重要的研究證明和理論依據(jù)。試驗一:IPEC-J2細(xì)胞中整聯(lián)蛋白亞基的鑒定采用細(xì)胞膜蛋白提取試劑盒提取IPEC-J2細(xì)胞膜蛋白,通過SDS-PAGE電泳分離細(xì)胞膜蛋白,根據(jù)整聯(lián)蛋白分子質(zhì)量為80-220 kDa的特點,將此區(qū)段的凝膠條帶進(jìn)行質(zhì)譜(Q-TOF)分析。采用免疫印跡的方法對質(zhì)譜檢測的整聯(lián)蛋白亞基結(jié)果進(jìn)行二次鑒定。質(zhì)譜與免疫印跡試驗的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn):分布于IPEC-J2細(xì)胞膜蛋白上的整聯(lián)蛋白亞基種類為5種,分別為α2,α3,α6,β1和β4。試驗二:整聯(lián)蛋白在IPEC-J2細(xì)胞增殖,細(xì)胞周期,細(xì)胞凋亡以及SBA引起IPEC-J2細(xì)胞周期與凋亡改變中的作用采用濃度為0,0.125,0.25,0.5,1.0和2.0 mg/mL SBA處理IPEC-J2細(xì)胞24 h,通過CCK-8試劑盒檢測不同水平SBA對IPEC-J2細(xì)胞增殖的影響,采用流式細(xì)胞儀測定SBA對IPEC-J2細(xì)胞周期及凋亡的影響。通過熒光定量PCR測定SBA處理前后,細(xì)胞周期相關(guān)基因CDK4,Cyclin E和Cyclin D1 mRNA表達(dá)量的變化情況。分別采用作用濃度為0,5,10及20μg/mL的整聯(lián)蛋白(α2,α3,α6,β1及β4)功能性抑制劑處理細(xì)胞24 h,用CCK-8試劑盒檢測不同整聯(lián)蛋白抑制劑對IPEC-J2細(xì)胞增殖的影響,同時篩選出整聯(lián)蛋白亞基抑制劑的最佳作用濃度。利用所篩選出的最佳作用濃度的SBA與整聯(lián)蛋白抑制劑進(jìn)行整聯(lián)蛋白功能性抑制試驗。試驗主要分為4組,分別為:0 mg/mL SBA處理組(對照組);SBA處理組;整聯(lián)蛋白抑制劑處理組;以及整聯(lián)蛋白(α2,α3,α6,β1及β4)抑制劑+SBA處理組,試驗24 h后,檢測不同整聯(lián)蛋白亞基抑制劑在IPEC-J2細(xì)胞增殖,周期,凋亡以及SBA引起的IPEC-J2細(xì)胞周期與凋亡改變中的作用。試驗結(jié)果表明:不同水平的SBA會通過阻滯IPEC-J2細(xì)胞周期于G0/G1期而顯著降低細(xì)胞增殖(P0.05),引起細(xì)胞凋亡(P0.05)。SBA會顯著下調(diào)細(xì)胞周期關(guān)鍵基因CDK4,Cyclin E和Cyclin D1的mRNA表達(dá)水平。整聯(lián)蛋白α2,α3,α6,β1和β4是維持IPEC-J2細(xì)胞正常增殖,周期及凋亡的重要蛋白,功能性抑制任何一種亞基均會引起細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期(P0.05),抑制IPEC-J2細(xì)胞增殖(P0.05),促進(jìn)細(xì)胞凋亡(P0.05)。除此之外,整聯(lián)蛋白α2,α6和β1參與SBA引起的IPEC-J2細(xì)胞周期改變過程(P0.05),而整聯(lián)蛋白α2,α3,α6,β1及β4參與SBA引起的IPEC-J2細(xì)胞凋亡過程。試驗三:SBA與整聯(lián)蛋白作用關(guān)系與連接方式的研究采用2.0 mg/mL SBA處理IPEC-J2細(xì)胞24 h,通過熒光定量PCR檢測SBA對整聯(lián)蛋白亞基α2,α3,α6,β1和β4 mRNA表達(dá)水平的影響;采用免疫共沉淀的方法分離IPEC-J2細(xì)胞膜上的SBA特異性結(jié)合蛋白,通過質(zhì)譜(Q-E)對SBA結(jié)合蛋白進(jìn)行鑒定;利用熒光定量PCR測定2.0 mg/mL SBA對α-輔肌動蛋白-2(ACTN2)基因表達(dá)量的影響;采用ACTN2-siRNA序列處理IPEC-J2細(xì)胞24 h,通過熒光定量PCR技術(shù)探索ACTN2與整聯(lián)蛋白(α2,α3,α6,β1和β4)基因表達(dá)水平之間的作用關(guān)系。試驗結(jié)果顯示:SBA顯著下調(diào)整聯(lián)蛋白α2,α3,α6,β1及β4的mRNA表達(dá)量(P0.05)。IPEC-J2細(xì)胞膜上含有67種SBA特異性結(jié)合蛋白,在這些SBA特異性結(jié)合蛋白中,不存在任何一種整聯(lián)蛋白亞基,說明SBA與整聯(lián)蛋白之間沒有發(fā)生直接連接作用,但是從檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了整聯(lián)蛋白連接蛋白,α-輔肌動蛋白-2(ACTN2,Accession:F1RHL9),且SBA會顯著降低ACTN2的mRNA表達(dá)量(P0.05)。除此之外,ACTN2基因沉默后,α2,α3,α6,β1及β4 mRNA表達(dá)量也隨著顯著降低(P0.05),表明SBA可能通過降低ACTN2基因表達(dá)水平,影響ACTN2與整聯(lián)蛋白之間的作用關(guān)系,降低整聯(lián)蛋白的mRNA表達(dá)量。綜上所述,表達(dá)于IPEC-J2細(xì)胞膜上的整聯(lián)蛋白亞基為α2,α3,α6,β1和β4,這些整聯(lián)蛋白亞基是維持IPEC-J2細(xì)胞正常代謝的重要蛋白。SBA可通過與ACTN2結(jié)合間接引起整聯(lián)蛋白基因表達(dá)量及功能的改變,進(jìn)而影響IPEC-J2細(xì)胞增殖,周期及凋亡等生命活動。以上研究結(jié)果為揭示SBA的抗?fàn)I養(yǎng)機(jī)制提供重要的依據(jù),同時整聯(lián)蛋白也可為如何改善SBA引起腸道增殖抑制和凋亡等領(lǐng)域的研究提供一條重要的研究思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S828

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本文編號：2404223