【摘要】：沙門菌能夠引起人和動(dòng)物的感染,是一種常見的人獸共患病原體。在全世界范圍內(nèi)廣泛流行,嚴(yán)重威脅人類健康,同時(shí)也給畜牧業(yè)及食品加工業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。沙門菌能夠形成生物被膜,生物被膜的形成使細(xì)菌對(duì)外界環(huán)境的抵抗力增強(qiáng),從而不易被消毒劑和抗生素清除,導(dǎo)致細(xì)菌的持續(xù)感染和反復(fù)感染。沙門菌生物被膜形成主要是由RpoS蛋白調(diào)控的,但也存在RpoS蛋白非依賴型生物被膜形成株。本研究利用結(jié)晶紫染色定量法測(cè)定120株沙門菌分離株的生物被膜形成能力；通過觸酶試驗(yàn)測(cè)定RpoS蛋白活性,確定rpoS基因依賴型和非依賴型生物被膜形成株；利用建立的熒光定量PCR方法比較rpoS基因依賴型和非依賴型生物被膜形成株在指數(shù)期和生物被膜形成期不同Sigma因子的基因表達(dá)差異；運(yùn)用Red同源重組系統(tǒng)構(gòu)建rpoE基因缺失株,并測(cè)定了缺失株的生物被膜形成能力和致病性,為進(jìn)一步闡明沙門菌生物被膜形成的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。1.沙門菌生物被膜形成相關(guān)Sigma因子的鑒定利用結(jié)晶紫染色定量法對(duì)120株不同來源的沙門菌進(jìn)行生物被膜形成能力測(cè)定,通過接種于剛果紅和考馬斯亮藍(lán)平板、熒光增白劑平板測(cè)定生物被膜成分,觸酶試驗(yàn)測(cè)定生物被膜形成株的RpoS蛋白活性,最后利用建立的熒光定量PCR方法對(duì)6個(gè)Sigma因子在指數(shù)期和生物被膜形成期的基因表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示,沙氏菌能在剛果紅和考馬斯亮藍(lán)平板上生長出四種菌落形態(tài),分別是紅色干燥粗糙型、棕色于燥粗糙型、粉色干燥粗糙型和白色光滑型菌落。熒光增白劑平板在紫外線下的熒光強(qiáng)度與生物被膜中纖維素的含量成正比。75%的沙門菌能夠形成生物被膜,其中rpoS基因非依賴型生物被膜形成株11株,rpoS基因依賴型生物被膜形成株79株。構(gòu)建6個(gè)Sigma因子的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,利用絕對(duì)定量繪制出6個(gè)Sigma因子的擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線。選取3株代表株檢測(cè)4-24h不同Sigma因子的基因表達(dá)量,結(jié)果顯示rpoS基因非依賴型生物被膜形成株在24 h生物被膜形成時(shí)期rpoE基因的表達(dá)量顯著高于其他5個(gè)Sigma因子。說明rpoE基因可能為rpoS基因非依賴生物被膜形成株中參與生物被膜形成的Sigma因子。2.沙門菌生物被膜形成相關(guān)Sigma因子缺失突變株的構(gòu)建選取兩株rpoS基因非依賴型生物被膜形成株雞白痢沙門菌S6702和鼠傷寒沙門菌S016,以及一株rpoS基因依賴型生物被膜形成株鼠傷寒沙門菌S025。采用Red同源重組法分別構(gòu)建rpoS和rpoE基因的缺失突變株,利用PCR、RT-PCR和回復(fù)試驗(yàn)鑒定證明6個(gè)基因缺失突變株構(gòu)建成功。生長曲線測(cè)定顯示,rpoS基因缺失株與野生株的生長速度無明顯差異；在雞白痢沙門菌S6702中,rpoE基因缺失株的生長速度高于野生株,而在鼠傷寒沙門菌S016和S025中,rpoE基因缺失株的生長速度低于野生株。結(jié)晶紫染色定量法測(cè)定缺失株的生物被膜形成能力結(jié)果顯示,在rpoS基因依賴株S025中,rpoS基因缺失后不能形成生物被膜；在非依賴株S6702和S016中,rpoS基因缺失后仍能形成生物被膜。rpoE基因缺失后均不能形成生物被膜。回復(fù)試驗(yàn)結(jié)果顯示,rpoS回復(fù)株與rpoE回復(fù)株和野生株的生物被膜形成能力類似。由此證明,rpoE基因?yàn)閰⑴c生物被膜形成新的Sigma因子。3.沙門菌rpoE基因缺失株的致病性研究對(duì)3株野生株S6702、S016、S025和6株基因缺失株(S6702△rpoE、S6702△rpoS, S016△rpoE, S016△rpoS, S025△rpoE, S025△rpoS)進(jìn)行HeLa細(xì)胞的黏附和侵入試驗(yàn)以及HD11巨噬細(xì)胞內(nèi)增殖試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示,缺失株△rpoS與野生株差異不顯著；在鼠傷寒沙門菌中缺失株△rpoE與野生株相比黏附率、侵入率和增值率均有所降低,而在雞白痢沙門菌中缺失株△rpoE的黏附率、侵入率和內(nèi)增殖率均有所升高。1日齡SPF雞致死性試驗(yàn)結(jié)果顯示,缺失株△rpoS的LD50均與野生株相似。在雞白痢沙門菌S6702株中,缺失株△rpoE的LD50有所下降；但在鼠傷寒沙門菌S016、S025株中,缺失株△rpoE的LD50均有所上升。細(xì)菌體內(nèi)分布試驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)口攻毒12 h后,6株缺失株與野生株在各臟器之間的分布無明顯差異。48 h時(shí),雞白痢沙門菌S6702中缺失株△rpoE比野生株在脾臟和膽汁中分布顯著增多；鼠傷寒沙門菌中缺失株△rpoE比野生株在脾臟和膽汁中分布略有降低,但差異不顯著。因此,rpoE基因?qū)Σ煌逍蜕抽T菌的致病性影響不一致。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.61

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本文編號(hào)：2404143