【摘要】：細(xì)胞因子是由機(jī)體免疫細(xì)胞和免疫相關(guān)細(xì)胞分泌的一類高活性多功能蛋白質(zhì)類物質(zhì),是細(xì)胞間的信號傳遞分子,調(diào)節(jié)和介導(dǎo)著體內(nèi)的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng),是機(jī)體免疫學(xué)功能發(fā)揮的必要成分。IL-2、IL-4、IL-18和IFN-γ都是機(jī)體免疫應(yīng)答不可缺少的成分,因其具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用而成為免疫佐劑研究的熱點(diǎn)。本研究對豬重組IL-2、IL-4和IFN-γ進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá),進(jìn)而開展了對口蹄疫合成肽疫苗免疫增強(qiáng)作用的研究,為細(xì)胞因子佐劑的臨床應(yīng)用提供了試驗(yàn)依據(jù);又對山羊重組IL-2、IL-4、IL-18和IFN-γ進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá),并進(jìn)行了各重組蛋白的生物學(xué)活性檢測和相應(yīng)抗血清抑制蛋白活性的研究。1.豬重組IL-2、IL-4和IFN-γ原核表達(dá)和生物學(xué)活性檢測對含有 pET28a-IL-2、pET32a-IL-4 和 pET28a-IFN-γ重組質(zhì)粒的 Rosetta2 陽性克隆菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),分別表達(dá)了相對分子量為21.4kDa、30.3kDa和20.7kDa的重組蛋白,并對包涵體蛋白進(jìn)行了純化和復(fù)性。通過CCK-8法檢測了重組蛋白IL-2和IL-4對豬外周血淋巴細(xì)胞的增殖活性,并利用VSV/PK15系統(tǒng)檢測了重組蛋白IFN-γ的抗病毒活性。結(jié)果顯示豬重組蛋白IL-2能顯著刺激外周血淋巴的增殖,并表現(xiàn)出一定的劑量依賴性,在蛋白濃度為10μg/mL時(shí)刺激效應(yīng)最強(qiáng),但當(dāng)超過10μg/mL時(shí)刺激增殖效應(yīng)開始減弱;重組蛋白IL-4不能有效刺激淋巴細(xì)胞的增殖,增殖效應(yīng)較弱;重組蛋白IFN-γ能有效抑制VSV在PK15細(xì)胞上的復(fù)制,具有良好的抗病毒作用,其抗VSV 活性為 1.135×1 04U/mg。2.豬重組IL-2、IL-4和IFN-γ對口蹄疫合成肽疫苗的免疫增強(qiáng)作用研究分別將原核表達(dá)的豬重組IL-2、IL-4和IFN-γ蛋白以15 μg/kg劑量與口蹄疫合成肽疫苗配伍免疫仔豬,并設(shè)空白對照組(PBS)、口蹄疫疫苗對照組、空載體蛋白對照組,檢測仔豬抗口蹄疫抗體水平和血清細(xì)胞因于IL-4、IL-10、IL-17和IFN-γ含量的變化,觀察其免疫佐劑效應(yīng)。結(jié)果表明:制備的IL-2、IL-4和IFN-γ重組蛋白均有較好的生物學(xué)活性,其中IL-2和IFN-γ重組蛋白均能顯著提高仔豬抗口蹄疫抗體水平(P0.01),而IL-4重組蛋白抑制口蹄疫抗體的產(chǎn)生(P0.01)。血清細(xì)胞因子檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)疫苗+IL-4組的IL-4和IL-10含量均較疫苗對照組顯著升高(P0.05),疫苗+IL-2組及疫苗+IFN-γ組的IFN-γ含量較疫苗對照組極顯著升高(P0.01)。結(jié)果提示,重組細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ分別作為免疫佐劑與口蹄疫疫苗配伍使用,能顯著增強(qiáng)機(jī)體的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。3.山羊重組IL-2、IL-4、IL-18和IFN-γ抗血清抑制重組蛋白活性分析將含 pET32a-IL-2、pET32a-IL-4、pET28a-IL-18 和 pET32a-IFN-γ重組質(zhì)粒的 BL21陽性克隆菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),分別表達(dá)了相對分子量為35.6 kDa、30.7 kDa、37.3 kDa和22.3 kDa的重組蛋白,并對表達(dá)的包涵體蛋白進(jìn)行了純化和復(fù)性。利用CCK-8法檢測了重組蛋白IL-2、IL-4和IL-18對山羊外周血淋巴細(xì)胞的增殖活性,通過巨噬細(xì)胞吞噬功能和硝酸還原酶法檢測了 IL-18對鼠腔來源巨噬細(xì)胞TQ噬中性紅和分泌NO能力的影響,并利用VSV/PK15系統(tǒng)檢測了 IFN-y重組蛋白的抗病毒活性,接著進(jìn)行相應(yīng)抗血清抑制上述重組蛋白活性的檢測。結(jié)果表明山羊重組蛋白IL-2、IL-4和IL-18能顯著刺激山羊外周血淋巴細(xì)胞的增殖,并表現(xiàn)出一定的劑量依賴性,三種重組蛋白分別在5μg/mL、25μg/mL和4μg/mL時(shí)刺激效應(yīng)最強(qiáng);IL-18對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅和分泌NO能力的影響也與其劑量密切相關(guān),在適宜的濃度范圍內(nèi)隨蛋白劑量增加而能力增強(qiáng),在IL-18濃度為0.25 μg/mL時(shí)巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力最強(qiáng),在IL-18濃度為1 μg/mL時(shí)分泌NO能力最強(qiáng)。山羊重組IFN-γ具有較好的抗病毒作用,其抗VSV活性為2.52×104U/mg�？寡宸忾]試驗(yàn)結(jié)果表明相應(yīng)抗血清能分別抑制上述重組蛋白生物學(xué)活性的發(fā)揮。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.4

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本文編號：2402754