【摘要】：玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEA)是由鐮刀菌產(chǎn)生的一種常見的具有類雌激素作用的真菌毒素。ZEA的毒性作用范圍廣泛,近年來人們發(fā)現(xiàn)ZEA可誘導(dǎo)睪丸間質(zhì)腫瘤的發(fā)生,但機(jī)制不明。所以,探究ZEA對睪丸間質(zhì)細(xì)胞作用的機(jī)制,對揭示ZEA誘導(dǎo)雄性動物睪丸間質(zhì)細(xì)胞腫瘤發(fā)生的機(jī)理具有重要意義。本試驗以TM3細(xì)胞(小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞系)為材料,研究暴露于低濃度ZEA下,TM3細(xì)胞增殖和遷移、細(xì)胞周期及相關(guān)調(diào)控蛋白的變化;利用二代高通量測序技術(shù),篩選了差異表達(dá)的miRNAs,并利用Parhway分析和GO分析對ZEA誘導(dǎo)TM3細(xì)胞腫瘤發(fā)生的相關(guān)通路和蛋白進(jìn)行了預(yù)測;通過實時定量PCR和免疫印跡法對篩選的miRNA和預(yù)測的信號通路相關(guān)蛋白進(jìn)行了驗證。1.ZEA對TM3細(xì)胞增殖活力及遷移的影響。用不同濃度 ZEA(Oμmol/L、0.01μmol/L、0.02μmol/L、0.03μmol/L、0.05μmol/L、0.1μmol/L、0.5μmol/L)處理 TM3 細(xì)胞 24h,CCK-8 法檢測 ZEA 對 TM3 細(xì)胞增殖活力影響;利用RTCA細(xì)胞實時監(jiān)測儀,監(jiān)測不同濃度ZEA(分組同上)對TM3細(xì)胞指數(shù)的影響;用不同濃度ZEA(Oμmol/L、0.01μmol/L、0.03μmol/L、0.05μmol/L、0.1μmol/L)處理細(xì)胞12h,Transwell試驗檢測細(xì)胞遷移的變化;RTCA 監(jiān)測暴露在不同濃度 ZEA(0μmol/L、0.01μmol/L、0.05μmol/L、0.1μmol/L)下,TM3細(xì)胞遷移率的變化;以0.01μmol/L濃度的ZEA染毒TM3細(xì)胞2h、6h、9h、18h,PI熒光染色法檢測TM3細(xì)胞周期的變化、免疫印跡法(Western Blot)檢測細(xì)胞周期調(diào)控蛋白Cyclin D1及其激酶Cdk4,Bcl-2基因家族成員的表達(dá)情況。結(jié)果:與對照組相比,0.05μmol/LZEA以下濃度染毒組細(xì)胞相對增殖活力極顯著升高(P0.01),0.1μmol/LZEA染毒組則顯著性升高(P0.05),而0.5μmol/LZEA染毒組差異不顯著(P≥0.05);RTCA結(jié)果顯示,染毒24h(細(xì)胞生長至45h)時,各染毒組CI較對照組均升高,但升高幅度隨染毒濃度的升高呈下降趨勢,0.1μmol/L ZEA以上濃度染毒組與對照組比較CI曲線變化不明顯;Transwell結(jié)果可見,隨著ZEA濃度升高,穿過小室的細(xì)胞越多,0.03μmol/L ZEA以下濃度染毒組較對照組差異顯著(P0.05),其余染毒組較對照差異極顯著(P0.01);RTCA監(jiān)測結(jié)果顯示,ZEA染毒30h后,0.01μmol/L染毒組遷移指數(shù)相比對照組逐漸升高,其余濃度組則變化不明顯;PI熒光染色法和免疫印跡法檢測結(jié)果顯示,隨著染毒時間的延長,分布于G1/G0期的細(xì)胞逐漸減少,向S期和G2期轉(zhuǎn)化,而細(xì)胞周期調(diào)控蛋白Cyclin D1及其激酶Cdk4蛋白表達(dá)量隨著染毒時間延長而逐漸上升(P0.01)。以上結(jié)果表明,低濃度的ZEA在一定濃度范圍內(nèi)對TM3細(xì)胞的增殖與遷移的能力具有促進(jìn)作用,選取0.011μmol/L濃度的ZEA作為測序濃度,染毒時間點選為2h、6h、18h。2.ZEA對TM3細(xì)胞microRNA表達(dá)的影響。用0.01μmol/L濃度ZEA處理TM3細(xì)胞Oh、2h、6h、18h,提取樣品總RNA,利用Illumina二代高通量測序平臺Hiseq 2000進(jìn)行深度測序分析;利用KEEP和GO分析,預(yù)測增殖、遷移相關(guān)miRNAs的靶基因與靶蛋白。結(jié)果:對照組得到9481806個miRNA讀段數(shù)、ZEA處理2h得到920676個miRNA讀段數(shù)、處理6h得到8779706個miRNA讀段數(shù)、處理18h得到9206769個miRNA的讀段數(shù)。其長度主要集中在21-24nt,正好是miRNA的典型長度。2h染毒組和正常組對比共有99個miRNA發(fā)生變化,其中上調(diào)有41個,58個下調(diào);6h和2h染毒組對比有100個miRNA表達(dá)存在差異,其中上調(diào)miRs有43個,57個下調(diào);18h和6h染毒組對比有138個miRs發(fā)生變化,其中49個miRs上調(diào),89個下調(diào);Parhway分析發(fā)現(xiàn),富集值較高的通路共有20條,而GO分析篩選出52個差異條目,其中包含MAPK信號通路、AMPK信號通路多條重要的增殖、遷移相關(guān)的信號通路,還包括NF-kappaB炎癥反應(yīng)信號通路。結(jié)合測序結(jié)果分析,同時查閱大量文獻(xiàn),按照增殖和遷移兩大功能分類,篩選出最可能受ZEA影響,調(diào)控TM3細(xì)胞增殖和遷移的相關(guān)5個miRs,及MAPK信號通路相關(guān)蛋白。3.高通量測序及靶蛋白預(yù)測結(jié)果的驗證。0.01μmol/LZEA分別處理TM3細(xì)胞Oh、2h、6h、18h,提取總RNA,利用實時定量PCR技術(shù)檢測表達(dá)差異的基因Let-7c-5p、miR-7a-5p、miR-10b-5p、miR-1Oa-5p、miR-21a-5p;采用蛋白免疫印跡法,檢測 MAPK 信號通路中相關(guān)蛋白ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、P38、p-P38,同時檢測內(nèi)參蛋白 p-Actin。結(jié)果:樣本RNA純度合格,染毒2h組與對照比,Let-7c-5p、miR-7a-5p、miR-10b-5p、miR-10a-5p表達(dá)均下調(diào),而miR-21a-5p表達(dá)上調(diào);隨著染毒時間增加,miR-21a-5p 和 miR-7a-5p 表達(dá)均下調(diào),而 Let-7c-5p、miR-10b-5p 和 miR-10a-5p 的表達(dá)均上調(diào),與測序結(jié)果一致,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);免疫印跡結(jié)果顯示,2h無明顯變化,但是隨著染毒時間增加,JNK磷酸化水平極顯著下降(P0.01);而ERK和P38在2h也無明顯變化,隨著時間增加其磷酸化水平極顯著上升(P0.01)。ZEA可以使miRNA的表達(dá)發(fā)生改變,影響MAPK信號通路,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與遷移過程。結(jié)論:低劑量ZEA對TM3細(xì)胞的增殖與遷移的能力具有促進(jìn)作用,并可以引起 miR-21a、let-7c-5p、miR-7a-5p、miR-10a-5p、miR-10b-5p 等腫瘤相關(guān) miRNA的表達(dá)異常,與MAPK信號通路中細(xì)胞增殖與遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)異常。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S859.8

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本文編號：2401460