發(fā)布時間：2018-12-20 10:17

【摘要】：鉛(Pb)是生態(tài)環(huán)境中的一種常見污染物,一旦進入生物機體便在體內(nèi)蓄積并對機體產(chǎn)生損傷。鉛對機體的損傷呈多系統(tǒng)和多器官性。腎臟是鉛損傷的重要靶器官,且近端小管是鉛腎臟損傷的靶部位。細胞自噬是一種進化上高度保守、維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的生物學(xué)過程,主要通過溶酶體對胞內(nèi)長壽蛋白,錯誤折疊蛋白和受損細胞器進行降解并循環(huán)利用。研究表明細胞自噬在多種毒物所致腎臟損傷中發(fā)揮重要的保護作用,但細胞自噬在鉛所致大鼠腎小管上皮(rPT)細胞毒性中的具體機制尚不清楚。溶酶體是細胞自噬降解過程中的關(guān)鍵細胞器。當(dāng)外界刺激誘發(fā)溶酶體膜通透化時,組織蛋白酶B和組織蛋白酶D從溶酶體釋放進入胞漿,可激活細胞凋亡途徑而發(fā)揮其細胞毒性作用。我們前期研究證實細胞凋亡是低劑量鉛(0-1.0μM)暴露所致rPT細胞死亡的主要途徑,但溶酶體膜通透化是否參與該過程尚未見報道。鑒于溶酶體在細胞自噬與細胞凋亡中的雙重調(diào)控作用,本研究以原代rPT細胞為研究對象,重點探討溶酶體功能異常,細胞凋亡與自噬抑制三者之間的關(guān)系,為從分子水平揭示鉛對腎臟的毒性損傷機理提供理論依據(jù)。首先,本研究對鉛所致自噬小體蓄積的原因進行了探究。通過蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測鉛暴露不同時間(3,6,12 h)自噬標志蛋白LC3-II的表達情況來反映鉛對自噬的影響,篩選出自噬現(xiàn)象最明顯時的鉛暴露時間和劑量進行后續(xù)試驗。結(jié)果表明鉛暴露可引起自噬小體的蓄積,在鉛濃度為0.5μM,處理時間為12 h時,自噬小體蓄積最明顯。采用兩種自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA,自噬前期)和氯喹(CQ,自噬后期)干預(yù)自噬,通過共聚焦顯微技術(shù)檢測兩種自噬抑制劑對鉛所致GFP-LC3瞬時轉(zhuǎn)染的rPT細胞中自噬小體數(shù)量變化的影響。采用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測在兩種自噬抑制劑存在或不存在情況下對鉛所致自噬標志蛋白LC3-II和p62/SQSTM1表達的影響。通過共聚焦顯微技術(shù)檢測鉛對RFP-GFP-LC3瞬時轉(zhuǎn)染的rPT細胞中自噬小體向溶酶體轉(zhuǎn)運的影響,進一步確定鉛對rPT細胞自噬流的影響。結(jié)果表明鉛通過抑制自噬引起自噬小體蓄積。其次,我們對自噬流抑制的具體機制進行了研究。采用內(nèi)源性LC3免疫熒光著色標記自噬小體,LAMP1免疫著色標記溶酶體,通過共聚焦顯微技術(shù)檢測鉛暴露對自噬小體和溶酶體融合的影響。使用Lyso-Tracker Red和Acridine Orange兩種溶酶體pH探針標記溶酶體,并通過共聚焦顯微技術(shù)檢測鉛對rPT細胞溶酶體pH的影響。隨后通過蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測鉛對調(diào)控細胞溶酶體酸性環(huán)境的3種V-ATPase蛋白表達的影響。結(jié)果表明鉛可能通過抑制2種溶酶體V-ATPases表達而升高溶酶體pH。采用共聚焦顯微技術(shù)和蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)分別檢測鉛對DQ-BSA-Green熒光強度和細胞總組織蛋白酶B、D蛋白表達的影響。研究結(jié)果表明鉛所致自噬阻滯不是由自噬小體與溶酶體融合受阻引起,而是由溶酶體功能受損(包括溶酶體堿化和溶酶體降解能力降低)引起。最后,我們對溶酶體膜通透化與細胞凋亡的聯(lián)系進行了研究。采用共聚焦顯微技術(shù)和蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)分別檢測鉛對組織蛋白酶B、D亞細胞分布的影響。同時,采用CA 074(組織蛋白酶B抑制劑)和Pep A(組織蛋白酶D抑制劑)分別預(yù)處理rPT細胞隨后進行鉛染毒,通過蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)、共聚焦顯微技術(shù)、流式細胞術(shù)分別檢測CA 074或Pep A與鉛共處理對鉛處理所致凋亡標志蛋白caspase-3剪切體、DAPI著染的細胞核形態(tài)、細胞凋亡率變化的影響。結(jié)果表明鉛可引起溶酶體膜通透化,導(dǎo)致組織蛋白酶B、D由溶酶體釋放進入胞漿,進而啟動細胞凋亡�？傊�,鉛暴露所致溶酶體功能受損(溶酶體堿化和溶酶體蛋白水解酶活性降低)導(dǎo)致自噬抑制,自噬流的阻滯導(dǎo)致腎毒性;鉛介導(dǎo)的溶酶體膜通透化可導(dǎo)致組織蛋白酶B、D由溶酶體釋放進入胞漿進而啟動細胞凋亡,引起腎毒性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S859.82

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本文編號：2387851