【摘要】：豬血凝性腦脊髓炎病毒(Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)屬于β冠狀病毒屬的成員,具有典型的嗜神經(jīng)特性。PHEV主要感染仔豬,尤其是3周齡以內(nèi)的仔豬,臨床表現(xiàn)為嘔吐、衰竭、腹瀉以及明顯的神經(jīng)癥狀,死亡率為20%-100%。目前針對(duì)該病還未見(jiàn)有效的預(yù)防及治療措施,一旦爆發(fā)將對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于該病毒主要侵害神經(jīng)系統(tǒng),但其所致神經(jīng)損傷的機(jī)制目前還不清楚,所以從病毒感染與宿主蛋白互作角度開展PHEV的致病機(jī)制研究具有重要的科學(xué)意義。micro RNAs(mi RNAs)是廣泛存在于各種真核生物中的長(zhǎng)度約為22nt的單鏈非編碼小RNA,在許多生物學(xué)和疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要的調(diào)控作用。例如,mi RNA在Ⅰ型單純胞疹病毒、流感病毒、丙型肝炎病毒等感染過(guò)程中通過(guò)調(diào)控靶基因表達(dá)而影響病毒在宿主細(xì)胞的復(fù)制增殖及釋放等過(guò)程。前期利用基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn),PHEV感染宿主過(guò)程中腦組織mi RN A表達(dá)譜發(fā)生巨大的變化,推測(cè)這些差異表達(dá)的宿主mi RNA可能在該病毒感染過(guò)程中起重要作用,這為深入研究PHEV的致病機(jī)制提供了新的思路。本實(shí)驗(yàn)選擇研究背景較為明確的mi R-21a-5p為研究對(duì)象,利用熒光定量PCR方法對(duì)PHEV感染宿主過(guò)程中mi R-21a-5p的表達(dá)變化進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比mi R-21a-5p表達(dá)量明顯上調(diào),推測(cè)其可能參與PHEV感染宿主的調(diào)控過(guò)程。進(jìn)而將化學(xué)合成的mi R-21a-5p模擬體或者抑制劑分別轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞再接種PHEV,利用熒光定量PCR方法檢測(cè)PHEV基因組RNA的含量。結(jié)果證實(shí),通過(guò)有效抑制或者過(guò)表達(dá)N2a細(xì)胞中mi R-21a-5p能使PHEV的復(fù)制增殖量減少或者增多。由此可見(jiàn),在PHEV感染過(guò)程中,宿主mi R-21a-5p的上調(diào)促進(jìn)了病毒基因組在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。為進(jìn)一步明確mi R-21a-5p調(diào)控PHEV復(fù)制的宿主靶點(diǎn),本研究運(yùn)用Target Scan、Microcosm Microcosm、Pic Tar三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)mi R-21a-5p的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)和功能分析,發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控突觸傳遞、軸突導(dǎo)向并在維持神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞骨架穩(wěn)定性相關(guān)的支架蛋白Caskin1可能在PHEV所致神經(jīng)功能損傷中起一定作用。為了確證Caskin1是否為mi R-21a-5p的靶基因,分別構(gòu)建包含Caskin1 3’UTR靶點(diǎn)及靶點(diǎn)位置堿基突變的雙熒光素酶報(bào)告載體系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明,Caskin1為mi R-21a-5p的直接靶點(diǎn)。將mi R-21a-5p模擬體或者抑制劑轉(zhuǎn)染入N2a細(xì)胞中,檢測(cè)Caskin1 m RNA及蛋白表達(dá)量。發(fā)現(xiàn)模擬體可顯著下調(diào)其表達(dá)量,而抑制劑可上調(diào)其表達(dá)量,進(jìn)一步證實(shí)Caskin1為mi R-21a-5p的靶基因。為探索mi R-21a-5p是否通過(guò)靶向Caskin1來(lái)促進(jìn)PHEV基因組在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制,利用si RNA使Caskin1在N2a細(xì)胞中低表達(dá),然后接種PHEV,檢測(cè)病毒基因組表達(dá)量明顯上調(diào),表明mi R-21a-5p可能是通過(guò)調(diào)控其靶基因Caskin1的表達(dá)來(lái)促進(jìn)PHEV基因組在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。為了確定mi R-21a-5p在PHEV對(duì)小鼠致病過(guò)程中的影響,將小鼠腦內(nèi)分別注射mi R-21a-5p antagomir、mi R-21a-5p antagomir NC、PBS,正常小鼠作為空白對(duì)照,接種PHEV后觀察小鼠生命體征、體重變化,并在接毒5d后檢測(cè)小鼠腦內(nèi)PHEV基因組RNA的含量及Caskin1表達(dá)量,結(jié)果顯示mi R-21a-5p antagomir可有效延緩PHEV感染小鼠的發(fā)病時(shí)間,并在一定程度上抑制了PHEV在小鼠腦組織的復(fù)制,同時(shí)小鼠腦組織Caskin1表達(dá)量升高,進(jìn)一步證明了Caskin1為mi R-21a-5p的靶基因。研究結(jié)果表明,降低小鼠腦組織中mi R-21a-5p的濃度可減輕PHEV感染的致病過(guò)程,且這一過(guò)程是通過(guò)mi R-21a-5p靶向調(diào)控Caskin1的表達(dá)進(jìn)而抑制PHEV基因組復(fù)制而實(shí)現(xiàn)的。綜上所述,PHEV感染宿主過(guò)程中mi R-21a-5p表達(dá)量上升,其通過(guò)靶向抑制Caskin1表達(dá)來(lái)促進(jìn)病毒基因組的復(fù)制,進(jìn)而加速了PHEV感染的致病過(guò)程。反之,小鼠體內(nèi)局部降低mi R-21a-5p濃度可一定程度上延緩PHEV感染的發(fā)生發(fā)展。這些研究成果不僅為mi RNA參與調(diào)控PHEV復(fù)制提供數(shù)據(jù)支持,也為深入研究PHEV的致病機(jī)制及治療方案提供新的思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2387419