【摘要】：隨著畜牧業(yè)集約化和產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展,養(yǎng)殖者都力求在最小的空間內(nèi)飼養(yǎng)更多的畜禽,導(dǎo)致養(yǎng)殖密度越來(lái)越大,盡管可以最大限度的提高畜禽的生產(chǎn)性能,降低勞動(dòng)成本,增加經(jīng)濟(jì)效益,但也容易帶來(lái)一些外在的不良因素,從而影響畜禽的生長(zhǎng)發(fā)育以及飼料報(bào)酬,最終引起畜禽產(chǎn)生疾病或死亡,給養(yǎng)殖者造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。這些因素包括高溫、缺氧、高壓、紫外線、組織感染、重金屬等,其中高溫環(huán)境帶來(lái)的不良影響尤其顯著。當(dāng)外界環(huán)境溫度在畜禽的舒適區(qū)溫度范圍時(shí),動(dòng)物就能正常生產(chǎn),發(fā)揮良好的繁殖性能;當(dāng)外界溫度與舒適區(qū)溫度不適應(yīng)時(shí),導(dǎo)致畜禽的生產(chǎn)性能等受到嚴(yán)重的影響,造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。本試驗(yàn)以較多在中國(guó)北方飼養(yǎng)的北京鴨和主要在南方飼養(yǎng)的番鴨為研究對(duì)象,重點(diǎn)研究了急性熱應(yīng)激對(duì)鴨肝臟功能代謝的影響。通過組織形態(tài)學(xué)觀察和抗氧化指標(biāo)的測(cè)定研究了熱應(yīng)激對(duì)鴨肝臟組織損傷及氧化功能的影響;通過熒光定量PCR研究了熱應(yīng)激狀態(tài)下鴨肝臟熱休克蛋白及炎性因子相關(guān)基因的表達(dá)水平;采用二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序RNA-Seq的方法分析了熱應(yīng)激前后番鴨肝臟組織中差異表達(dá)的基因情況;利用體外培養(yǎng)的方法,研究了 HSP70-siRNA對(duì)鴨肝細(xì)胞細(xì)胞凋亡信號(hào)通路關(guān)鍵基因表達(dá)的影響;運(yùn)用了蛋白質(zhì)組學(xué)的方法,研究了熱應(yīng)激對(duì)北京鴨和番鴨肝臟組織蛋白表達(dá)的影響;同時(shí),我們還根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果,克隆了部分與熱應(yīng)激相關(guān)的基因,分析了兩個(gè)鴨種間的序列結(jié)構(gòu)差異。1.急性熱應(yīng)激對(duì)北京鴨和番鴨肝臟組織抗氧化系統(tǒng)、炎性因子及熱休克蛋白的影響熱應(yīng)激嚴(yán)重影響家鴨存活率、產(chǎn)蛋率及肉質(zhì)性能。本試驗(yàn)旨在研究急性熱應(yīng)激對(duì)北京鴨和番鴨肝臟組織病理?yè)p傷、抗氧化酶活性(SOD、MDA、CAT、T-AOC)、炎性因子及熱休克蛋白的影響。鴨被暴露于39±0.5℃下1h,然后迅速轉(zhuǎn)入20℃中恢復(fù)1h和3h,迅速采集各溫度下的鴨肝臟組織用于后續(xù)分析。結(jié)果顯示,熱應(yīng)激導(dǎo)致北京鴨和番鴨都出現(xiàn)不同程度的組織損傷,但北京鴨肝臟損傷情況更加嚴(yán)重;熱應(yīng)激1h后,番鴨肝臟組織抗氧化酶(SOD、MDA、CAT、T-AOC)活性均出現(xiàn)上調(diào),而北京鴨則下調(diào),恢復(fù)期鴨肝臟組織抗氧化酶活性均下調(diào);與對(duì)照組相比,熱應(yīng)激后鴨肝臟組織中HSP70,HSP60,HSP40基因表達(dá)水平均出現(xiàn)上調(diào)的現(xiàn)象;番鴨肝臟組織中HSP10基因表達(dá)上調(diào),北京鴨則無(wú)明顯變化;相反地,應(yīng)激組HSP90基因表達(dá)水平在均顯著下降。熱應(yīng)激狀態(tài)下,番鴨iNOS基因水平有明顯的上升,北京鴨則有明顯的下降;COX-2基因表達(dá)水平在鴨肝臟組織中均出現(xiàn)上調(diào)的現(xiàn)象。綜上所述,急性熱應(yīng)激能夠影響北京鴨和番鴨肝臟組織形態(tài)學(xué)特征,導(dǎo)致其抗氧化機(jī)能發(fā)生改變,并顯著影響鴨肝臟組織內(nèi)HSP基因與相關(guān)炎性因子的表達(dá)水平。與北京鴨相比,番鴨具有更強(qiáng)的熱應(yīng)激抵抗能力。2.熱應(yīng)激番鴨肝臟組織轉(zhuǎn)錄組分析在本試驗(yàn)中,運(yùn)用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)分析了番鴨在熱應(yīng)激后肝臟組織中轉(zhuǎn)錄組水平上所有基因表達(dá)水平的情況。結(jié)果顯示:de novo測(cè)序總共獲得超過225,000,000個(gè)原始reads,對(duì)應(yīng)產(chǎn)生22.75 Gb數(shù)據(jù)。從頭拼接組裝后,產(chǎn)生36,903個(gè)Unigenes,平均長(zhǎng)度為1,135bp,其中21,221(57.50%)個(gè)Unigenes有注釋。對(duì)有注釋的Unigenes進(jìn)行GO分析發(fā)現(xiàn),富集最多的是轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及凋亡通路。同時(shí),我們對(duì)熱應(yīng)激組及對(duì)照組數(shù)據(jù)比較分析發(fā)現(xiàn),共產(chǎn)生470個(gè)差異表達(dá)的基因,240個(gè)基因表達(dá)上調(diào),230個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。GO富集分析顯示這些基因主要與蛋白質(zhì)折疊及伴侶綁定有關(guān);KEGG通路分析發(fā)現(xiàn),番鴨熱應(yīng)激后,Ras和MAPKs信號(hào)通路被激活。同時(shí),我們對(duì)主要的幾個(gè)基因進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證。本研究豐富了番鴨基因組的序列信息,對(duì)研究鴨在抗熱應(yīng)激中的反應(yīng)提供了新的視角,分析得到的相關(guān)差異基因可以作為今后的候選基因,為培育鴨耐熱品系提供理論數(shù)據(jù)。3.抑制HSP70基因表達(dá)對(duì)鴨肝臟細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響研究表明,在不良刺激影響下,HSP自身可以調(diào)控細(xì)胞的凋亡。本試驗(yàn)利用鴨肝細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法,研究HSP70-siRNA對(duì)鴨肝臟細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路關(guān)鍵基因表達(dá)的影響。試驗(yàn)采用常用的二步灌流分離法,得到了活力較高的鴨肝臟細(xì)胞,隨后進(jìn)行HSP70基因干擾試驗(yàn)。結(jié)果表明,HSP70-siRNA處理細(xì)胞CCO基因表達(dá)水平提高1156.7%(P0.01)、SAPK基因表達(dá)水平提高733.3%(P0.01)、p38MAPK基因表達(dá)量降低70.0%(P0.01)、RASA1基因表達(dá)量降低83.4%(P0.01)。4.急性熱應(yīng)激前后北京鴨與番鴨肝臟蛋白質(zhì)代謝的研究本試驗(yàn)運(yùn)用蛋白組學(xué)的方法,研究北京鴨與番鴨中與耐熱相關(guān)的蛋白。鴨被暴露于39±0.5℃下1h,然后迅速轉(zhuǎn)入20℃環(huán)境中恢復(fù)3h,采集各溫度下的鴨肝臟組織,提取肝蛋白用于2D電泳分析。凝膠圖像分析之后,共發(fā)現(xiàn)61個(gè)差異表達(dá)的蛋白,其中54個(gè)經(jīng)MALDI TOF/TOF MS成功鑒定。在這54個(gè)蛋白中,7個(gè)蛋白共同存在于北京鴨和番鴨中,47個(gè)為單獨(dú)存在(25在番鴨,22在北京鴨中)。分析這些蛋白發(fā)現(xiàn),分子伴侶相關(guān)蛋白如HSP70和HSP10,在北京鴨和番鴨中都出現(xiàn)顯著的上調(diào)。然而,本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)其它的一些蛋白,例如α烯醇化酶(α-enolase),S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine synthetase),在北京鴨和番鴨中呈相反地表達(dá)趨勢(shì)。根據(jù)GO富集分析顯示,差異表達(dá)的蛋白主要富集在細(xì)胞死亡與凋亡(20.93%)、氨基酸代謝(13.95%)和氧化還原(20.93%)三大類。同時(shí),我們選取幾個(gè)差異表達(dá)的蛋白所對(duì)應(yīng)的基因進(jìn)行了RT-PCR驗(yàn)證。本文第一次從蛋白組學(xué)方向研究了北京鴨和番鴨在對(duì)抗熱應(yīng)激時(shí)的蛋白表達(dá)差異,為今后更好的理解熱應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制,耐熱品種的培育提供可靠的理論數(shù)據(jù)。5.番鴨ENO1基因cds序列克隆及結(jié)構(gòu)分析溫度能夠影響蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,導(dǎo)致蛋白質(zhì)的功能如配體的識(shí)別與結(jié)合等發(fā)生改變,從而使其對(duì)熱敏感。因此,蛋白質(zhì)氨基酸的自然進(jìn)化應(yīng)朝向其能在特殊的熱環(huán)境中發(fā)揮良好功能的方向進(jìn)行。本試驗(yàn)根據(jù)前面試驗(yàn)得到的北京鴨番鴨差異表達(dá)蛋白的數(shù)據(jù),挑選出α-enolase(ENO1)這一蛋白,以GenBank上公布的綠頭野鴨ENO1基因序列為參考,克隆番鴨ENO1基因cds序列,分析ENO1基因序列及結(jié)構(gòu)的差異,探討該基因結(jié)構(gòu)的變化對(duì)北京鴨和番鴨耐熱性差異可能造成的影響。結(jié)果表明,番鴨ENO1基因cds序列含有1305堿基,共編碼434個(gè)氨基酸;北京鴨ENO1基因(GI213090)與番鴨ENO1基因的cds序列共存在21個(gè)堿基的差異;在蛋白序列上共存在5個(gè)氨基酸的差異。其中,北京鴨第171位和173位分別為脯氨酸(P)和半胱氨酸(C),而番鴨分別為亮氨酸(L)和纈氨酸(V)。纈氨酸(V)為非極性氨基酸(疏水),而半胱氨酸為極性氨基酸(親水),同時(shí),在α-enolase三級(jí)結(jié)構(gòu)中,171位和173位同時(shí)位于β折疊的最上沿,對(duì)于進(jìn)入蛋白催化區(qū)域的底物具有一定的指導(dǎo)作用,這可能與北京鴨和番鴨耐熱性的不同有關(guān)。綜上所述,急性熱應(yīng)激對(duì)北京鴨與番鴨肝臟組織均有不同程度的損傷,但比較發(fā)現(xiàn),番鴨具有更好的耐熱能力。肝臟組織轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),北京鴨和番鴨耐熱性的差異可能主要與機(jī)體內(nèi)能量供應(yīng)和抗氧化能力有關(guān)。本研究為鴨抗熱應(yīng)激的分子調(diào)控機(jī)理及分子輔助育種奠定了基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S834

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2386627