【摘要】：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是生物學(xué)研究領(lǐng)域的重要材料,篩選標(biāo)記基因被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)過(guò)程中,然而篩選標(biāo)記的殘留存在生物安全隱患。利用Cre/Loxp重組系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)刪除篩選標(biāo)記基因的目的。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了pEGFP-N1-LacS載體,通過(guò)電轉(zhuǎn)染方法使該載體與體外轉(zhuǎn)錄所得的phiC31整合酶mRNA共同轉(zhuǎn)染了奶牛胎兒皮膚成纖維細(xì)胞,使LacS基因定點(diǎn)整合入奶牛胎兒皮膚成纖維細(xì)胞基因組上,篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的表達(dá)綠色熒光的陽(yáng)性細(xì)胞株。再利用Cre穿膜肽對(duì)表達(dá)綠色熒光的陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行孵育,切除篩選標(biāo)記基因,獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的無(wú)綠色熒光的細(xì)胞系,為培育無(wú)篩選標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)LacS基因克隆奶牛奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果概括如下：1.以pEGFP-N1為骨架載體,將合成的；attB序列和優(yōu)化的LacS基因克隆入pEGFP-N1,并在相應(yīng)位置利用PCR引物添加同方向的兩個(gè)Loxp序列,構(gòu)建了真核表達(dá)載體p-EGFP-N1-LacS。2.將p-EGFP-N1-LacS質(zhì)粒和phiC31整合酶mRNA通過(guò)電轉(zhuǎn)染的方法共轉(zhuǎn)染奶牛胎兒皮膚成纖維細(xì)胞,使目的基因定點(diǎn)整合入奶�；蚪M,經(jīng)過(guò)400μg/mL G418篩選出表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞系。3.將pET-28a(-)-His-NLS-TAT-Cre質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞并誘導(dǎo)表達(dá)Cre重組蛋白,經(jīng)過(guò)純化得到Cre穿膜肽,利用Cre穿膜肽對(duì)表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞株進(jìn)行37-C孵育,切除標(biāo)記基因。篩選出去除篩選標(biāo)記基因的無(wú)綠色熒光的細(xì)胞系,即得到可定點(diǎn)整合并且無(wú)篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)LacS的奶牛細(xì)胞系。
[Abstract]:Transgenic animals are important materials in the field of biological research. Screening marker genes are widely used in the production process of transgenic animals. Cre/Loxp recombination system can be used to delete the screening marker gene. In this study, pEGFP-N1-LacS vector was constructed and co-transfected into bovine fetal skin fibroblasts by electrotransfection with phiC31 integrase mRNA transcribed in vitro. The LacS gene was integrated into the genome of bovine fetal skin fibroblasts, and a stably transfected positive cell line expressing green fluorescence was selected. The Cre transmembrane peptide was used to incubate the positive cells expressing green fluorescence, and the labeled genes were removed and screened. The stable transfected cell lines without green fluorescence were obtained, which laid the foundation for the cloning of dairy cows with the transgenic LacS gene without screening marker gene. The main results are summarized as follows: 1. Using pEGFP-N1 as skeleton vector, the synthesized attB gene and optimized LacS gene were cloned into pEGFP-N1, and PCR primers were used to add two Loxp sequences in the same direction. The eukaryotic expression vector p-EGFP-N1-LacS.2 was constructed. The p-EGFP-N1-LacS plasmid and phiC31 integrase mRNA were co-transfected into bovine fetal skin fibroblasts by electrotransfection, and the target gene was integrated into the bovine genome. The cell lines expressing green fluorescence were screened by 400 渭 g/mL G418. PET-28a (-)-His-NLS-TAT-Cre plasmid was transformed into BL21 (DE3) competent cells and expressed Cre recombinant protein. Cre transmembrane peptide was purified and incubated with Cre transmembrane peptide for 37-C. Excision of marker gene. The cell lines without green fluorescence were screened out, that is, the cow cell lines which could be integrated at fixed point and transformed into LacS without screening markers were obtained.
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S823

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本文編號(hào)：2386124