發(fā)布時間：2018-12-18 11:13

【摘要】：本研究旨在利用p SET4s,通過基因同源重組技術(shù),將外源基因豬表皮生長因子(EGF)和綠色熒光蛋白(GFP)整合到到嗜酸乳桿菌基因組中,通過抗性篩選與鑒定,獲得能夠穩(wěn)定表達(dá)GFP和豬EGF的重組嗜酸乳桿菌,并對其進(jìn)行生物學(xué)特性研究。試驗(yàn)一:p SET4s用于嗜酸乳桿菌基因重組可行性的分析(1)p S ET4s電轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化試驗(yàn)表明,嗜酸乳桿菌培養(yǎng)過夜至OD6 0 0為0.6和終濃度為1.0%的甘氨酸L B培養(yǎng)基均有利于提高p S E T 4 s質(zhì)粒在嗜酸乳桿菌中轉(zhuǎn)化效率。(2)p S ET4s用于嗜酸乳桿菌基因重組可行性分析通過平板計(jì)數(shù)的方法對轉(zhuǎn)入到嗜酸乳桿菌中的p S ET4s進(jìn)行2 8℃穩(wěn)定性和3 7℃丟失率的分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在2 8℃條件下能夠穩(wěn)定存在;在37℃時,培養(yǎng)16 h后質(zhì)粒完全丟失。因此p S ET4s穿梭載體用于嗜酸乳桿菌的基因重組是可行的。試驗(yàn)二:共表達(dá)GFP和豬EGF重組嗜酸乳桿菌的構(gòu)建通過PC R擴(kuò)增獲得嗜酸乳桿菌基因組中誘導(dǎo)表達(dá)位點(diǎn)和強(qiáng)啟動子表達(dá)位點(diǎn)的上游同源臂P1、P3和下游同源臂P2、P 4片段,將拼接正確的EGF基因和GFP基因與上下游同源臂及線性化的載體p SET4s進(jìn)行連接,對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和PCR鑒定,并命名p SET4s-P 1-EGF+GFP-P2和p SET4s-P 3-EGF+GFP-P4。將重組質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化到嗜酸乳桿菌MG6243中,通過抗性和溫度雙重篩選得到重組嗜酸乳桿菌,并通過PC R方法對重組嗜酸乳桿菌進(jìn)行鑒定,并命名為ΔM G6243-1和ΔMG6243-2。試驗(yàn)三:重組嗜酸乳桿菌生物學(xué)特性研究(1)GFP和EGF在重組嗜酸乳桿菌的表達(dá)提取蛋白后,分別進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色和Western bl ot分析,結(jié)果表明重組菌具有分子量大小與理論相符的明顯的差異蛋白條帶,熒光顯微鏡觀察重組菌具有綠色熒光;elisa檢測發(fā)現(xiàn),重組菌能夠穩(wěn)定表達(dá)egf,且濃度可以達(dá)到3.1ng/ml;表明表達(dá)gfp和egf基因的重組嗜酸乳桿菌構(gòu)建成功。(2)重組嗜酸乳桿菌的遺傳穩(wěn)定性分析傳代10代后的重組菌仍然能擴(kuò)增出目的基因條帶和檢測到綠色熒光,說明gfp基因能夠在所構(gòu)建的重組菌中穩(wěn)定遺傳。(3)重組嗜酸乳桿菌的生長特性、酸堿鹽的耐受性的研究通過平板計(jì)數(shù)的方法對重組菌的生長特性、酸堿鹽的耐受性進(jìn)行了研究,結(jié)果表明嗜酸乳桿菌與兩株重組嗜酸乳桿菌相比,生長特性沒有明顯的變化,也都表現(xiàn)出一定的耐酸能力和膽鹽耐受性。試驗(yàn)四:重組嗜酸乳桿菌對小鼠腸道作用的研究(1)選取6-8周齡體重約20g的雌性昆明小鼠,進(jìn)行灌服試驗(yàn),結(jié)果顯示:與對照組相比,灌服嗜酸乳桿菌菌液降低了小鼠回腸隱窩深度(p0.05),提高了回腸絨毛高度/隱窩深度比值(p0.05);與對照組相比,灌服Δmg6243-1和誘導(dǎo)表達(dá)的Δmg6243-1菌液均提高了小鼠十二指腸絨毛高度(p0.05),降低了十二指腸和回腸隱窩深度(p0.05),提高了十二指腸和回腸絨毛高度/隱窩深度比值(p0.05),而灌服誘導(dǎo)表達(dá)的Δmg6243-1菌液還顯著提高了回腸絨毛高度(p0.05);灌服Δmg6243-2菌液提高了小鼠十二指腸和空腸絨毛高度(p0.05),顯著降低了小鼠十二指腸和回腸隱窩深度(p0.05),并且顯著提高了十二指腸和回腸絨毛高度/隱窩深度比值(p0.05)。(2)試驗(yàn)選取6-8周齡體重約20g的雌性昆明小鼠,研究重組菌對小鼠小腸的修復(fù)作用。結(jié)果顯示:lps刺激導(dǎo)致了小鼠十二指腸和空腸絨毛高度降低(p0.05),同時降低了十二指腸、空腸和回腸絨毛高度/隱窩深度比值(p0.05)。與lps組相比,灌服嗜酸乳桿菌菌液提高了回腸絨毛高度/隱窩深度比值(P0.05);與LP S組相比,ΔMG6243-1組十二指腸和回腸絨毛高度/隱窩深度比值升高(P0.05);灌服誘導(dǎo)表達(dá)的ΔMG6243-1菌液顯著提高了十二指腸、空腸和回腸絨毛高度以及絨毛高度/隱窩深度比值(P0.05);與LP S組相比,灌服ΔMG6243-2菌液后,提高了空腸絨毛高度和十二指腸回腸絨毛高度/隱窩深度比值(P0.05),顯著降低了回腸隱窩深度(P0.05)。結(jié)論:成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)GFP和EGF的重組嗜酸乳桿菌;重組嗜酸乳桿菌和嗜酸乳桿菌的生長特性沒有顯著差異;在p H 2.0、p H 2.5、p H 4.0和膽鹽濃度分別為0.2%、0.5%、0.8%時,三株菌的耐受性無顯著差異,但在p H 3.0和膽鹽濃度為1.0%的條件下,重組嗜酸乳桿菌ΔMG6243-2的耐酸性和耐膽鹽能力都比重組嗜酸乳桿菌ΔMG6243-1和嗜酸乳桿菌要低;重組嗜酸乳桿菌能維持小鼠腸道健康,并在一定程度上改善了LPS刺激小鼠小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：武漢輕工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S816

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2385759