【摘要】：長鏈非編碼RNAs(long noncoding RNA,lnc RNAs)是一類本身不編碼蛋白、轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的RNA分子,它可以在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多種層面上調(diào)控基因的表達(dá)。由于許多l(xiāng)nc RNAs僅在特定的發(fā)育階段出現(xiàn),而且羊絨的生長具有周期性的特點(diǎn),因此本研究利用RNA-seq技術(shù),對羊絨生長期和休止期的皮膚組織分別進(jìn)行de novo測序及生物信息學(xué)分析,通過對羊絨生長期和休止期顯著差異表達(dá)lnc RNAs的篩選及q RT-PCR驗(yàn)證,對其中的5個(gè)lnc RNAs構(gòu)建了過表達(dá)載體,為進(jìn)一步研究lnc RNAs的功能和探討特異性lnc RNAs在羊絨生長中的作用提供理論依據(jù)。獲得的結(jié)果如下:1.RNA-seq的結(jié)果分析:RNA-seq得到的轉(zhuǎn)錄組的reads數(shù)量在生長期和休止期分別為51531778和61750544,表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量為37574和37619;兩個(gè)時(shí)期表達(dá)的基因數(shù)量為37649,其中差異表達(dá)的基因數(shù)量為977個(gè)(P0.05),表達(dá)上調(diào)的基因有559個(gè),下調(diào)的基因有418個(gè);兩個(gè)時(shí)期表達(dá)的lnc RNAs的數(shù)量是6127個(gè),只有54個(gè)lnc RNAs差異表達(dá),其中上調(diào)的32個(gè),下調(diào)的為22個(gè)。GO分析結(jié)果表明,這些轉(zhuǎn)錄本在分子功能,細(xì)胞組成和生物學(xué)進(jìn)程中具有重要作用,包括Hox A、Hox B、Hox C和Hox D家族基因,BMPs家族以及KAPs、FGFs基因及其受體基因等。KEGG的分析結(jié)果表明有些lnc RNAs與信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制相關(guān)。2.利用q RT-PCR對10個(gè)生長期和休止期顯著差異表達(dá)的lnc RNAs進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明:這10個(gè)lnc RNAs相對表達(dá)量的q RT-PCR結(jié)果與RNA-seq測序結(jié)果的趨勢一致,但是lnc RNA9686的差異不顯著。3.對于驗(yàn)證的lnc RNA9686、lnc RNA14672、lnc RNA19457、lnc RNA15479和lnc RNA13025,用p B-CMV-Ds Red-CMV-GFP.BS.with repeats的骨架載體利用PCR及雙酶切連接的方法構(gòu)建過表達(dá)載體,通過雙酶切及測序驗(yàn)證,表明過表達(dá)載體構(gòu)建成功,為進(jìn)一步研究lnc RNAs的功能奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Long chain noncoding RNAs (long noncoding RNA,lnc RNAs) is a class of RNA molecules which do not encode proteins and whose transcripts are more than 200 nt in length. They can regulate the expression of genes at many levels, such as epigenetic regulation, transcriptional regulation and posttranscriptional regulation. Due to the fact that many lnc RNAs only occur at specific developmental stages and the growth of cashmere is periodic, the RNA-seq technique is used in this study. De novo sequencing and bioinformatics analysis were performed on the skin tissues of cashmere during growth period and rest period respectively. The expression of lnc RNAs was screened and verified by Q RT-PCR. The overexpression vectors of five of them were constructed to provide theoretical basis for further study of the function of lnc RNAs and the role of specific lnc RNAs in cashmere growth. The results were as follows: the results of 1.RNA-seq analysis showed that the reads number of the transcriptome obtained by RNA-seq was 51531778 and 61750544 during the growth period and the rest period, and the number of expressed transcripts was 37574 and 37619 respectively. The number of genes expressed in the two periods was 37649, among which 977 genes were differentially expressed (P0.05), 559 genes were up-regulated and 418 genes were down-regulated. The number of lnc RNAs expressed in the two periods was 6127, with only 54 lnc RNAs differentially expressed, of which 32 were up-regulated and 22 were down-regulated. GO analysis showed that these transcripts were functionally active. Cell composition and biological processes play an important role, including Hox, Hox C and Hox D genes, BMPs family, and KAPs, FGFs gene and its receptor gene, etc. The results of KEGG analysis showed that some lnc RNAs were related to signal transduction mechanism. 2. Q RT-PCR was used to verify the expression of 10 lnc RNAs with significant difference in growth period and rest period. The results showed that the Q RT-PCR results of the relative expression of 10 lnc RNAs were consistent with the results of RNA-seq sequencing. But the difference in lnc RNA9686 was not significant. For the verified lnc RNA9686,lnc RNA14672,lnc RNA19457,lnc RNA15479 and lnc RNA13025, the overexpression vector was constructed by using the framework vector of p B-CMV-Ds Red-CMV-GFP.BS.with repeats by PCR and double enzyme ligation, and the expression vector was confirmed by double enzyme digestion and sequencing. The results showed that the overexpression vector was successfully constructed, which laid a foundation for further study on the function of lnc RNAs.
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S827

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本文編號(hào)：2383904