【摘要】：資源過度開發(fā)帶來的環(huán)境污染導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境急劇惡化,這可能與近年人類生殖能力的急速下降有關(guān)。已有的體內(nèi)/體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示多環(huán)芳烴家族的多個(gè)成員均能引起生殖健康問題。7,12-二甲基苯并蒽是多環(huán)芳烴類化學(xué)物質(zhì)中的一員(7,12-dimethylbenz(a)anthracene,DMBA),能破壞嚙齒類動(dòng)物卵巢中各發(fā)育階段卵泡。但其對(duì)于卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟的影響仍不清楚,尤其是在大動(dòng)物(豬)模型上仍是空白。卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟包括核成熟,胞質(zhì)成熟和核質(zhì)成熟的協(xié)同性三個(gè)方面。本研究中,利用豬卵母細(xì)胞體外成熟系統(tǒng),我們研究了DMBA對(duì)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟的影響,并試圖解析其影響機(jī)制,從而增加人們對(duì)環(huán)境污染物影響生殖的了解。主要研究結(jié)果如下:(1)不同濃度DMBA(10μM和20μM)成熟培養(yǎng)豬卵丘-卵復(fù)合體(Cumulus-oocyte complexes,COCs)和裸卵(cumulus-denuded oocytes,DOs),結(jié)果顯示20μM DMBA提高COC組44 h卵母細(xì)胞第一極體排出率(88.2%vs.76.4%,P0.05),而10μM DMBA沒有顯著改變(83.0%vs.76.4%,P0.05)。10μM和20μM DMBA不影響裸卵組44 h卵母細(xì)胞第一極體排出率(69.7%,73.5%vs.77.1%;P0.05)。進(jìn)一步剖析COC組核進(jìn)程發(fā)現(xiàn)20μM DMBA處理顯著升高18 h GVBD率(35.1%vs.19.5%,P0.05),而顯著降低24 h GVBD率(61.3%vs.74.7%,P0.05)。甘珀酸(Carbenoxolone,CBX)抑制COC組的縫隙連接顯著降低20μM DMBA提高的極體排放率(64.1%vs.87.0%,P0.05),但對(duì)DO組的極體排出率沒有影響(68.3%vs.71.0%,P0.05)。這些結(jié)果表明卵丘細(xì)胞可能通過縫隙連接介導(dǎo)DMBA對(duì)豬卵的核成熟效應(yīng)。免疫印跡試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)20μM DMBA顯著升高COC組卵母細(xì)胞中的p ERK1/2(T202/Y204)的水平(1.2 vs.1.0,P0.05),但不改變p CDK1(T161)的水平(1.0 vs.1.0,P0.05)。絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路抑制劑U0126降低20μM DMBA誘導(dǎo)的COC組第一極體排出升高效應(yīng)(24.4%vs.94.2%;P0.05)。磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)信號(hào)通路抑制劑U73122也具有類似的效應(yīng)(80.5%vs.94.2%;P0.05)。但AHR信號(hào)通路抑制劑Alpha-NF不能改變DMBA的促第一極體排出效應(yīng)(89.8%vs.90.7%;P0.05)。這些結(jié)果說明,卵丘細(xì)胞通過影響COC組豬卵母細(xì)胞中的PLC和MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)20μM DMBA對(duì)核成熟的效應(yīng)。(2)20μM DMBA顯著下調(diào)COC組卵母細(xì)胞的H3K9me3(0.6 vs.1.0;P0.05)和H3K27me3水平(0.6 vs.1.0;P0.05),顯著上調(diào)H3K36me3水平(1.3 vs.1.0;P0.05),使卵母細(xì)胞基因組處于相對(duì)激活狀態(tài)。RT-q PCR結(jié)果顯示20μM DMBA顯著下調(diào)G9a(0.8vs.1.0;P0.05)和Eed(0.8 vs.1.0;P0.05)mRNA的豐度。在DO系統(tǒng)中,20μM DMBA不影響卵母細(xì)胞中H3K9me3,H3K27me3和H3K36me3的水平。20μM DMBA能顯著增強(qiáng)COC組卵母細(xì)胞中的γH2A.X免疫熒光信號(hào)(2.9 vs.0.5;P0.05)和蛋白水平(1.3 vs.1.0;P0.05),但在DO系統(tǒng)中并不影響γH2A.X免疫熒光信號(hào)(0.6 vs.0.7;P0.05)。Annexin V檢測(cè)卵母細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)20μM DMBA顯著提高COC組卵母細(xì)胞的凋亡比例(41.5%vs.13.9%;P0.05),但不影響DO組卵母細(xì)胞的早期凋亡(11.3%vs.13.9%;P0.05)。這些結(jié)果表明,卵丘細(xì)胞介導(dǎo)了DMBA誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞染色體相關(guān)事件,以及其下游事件的改變效應(yīng),如組蛋白修飾狀態(tài),DNA雙鏈斷裂損傷和其可能導(dǎo)致的早期凋亡事件。(3)對(duì)于卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟,20μM DMBA顯著提高COC和DO組卵母細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平(COC,7.6 vs.1.0,P0.05;DO,13.8 vs.1.0,P0.05),顯著降低線粒體膜電位水平(COC,0.7 vs.1.0,P0.05;DO,0.9 vs.1.0,P0.05)。有趣的是我們還發(fā)現(xiàn)DMBA處理誘導(dǎo)COC和DO組卵母細(xì)胞(12,18,24,44 h)胞質(zhì)產(chǎn)生藍(lán)色熒光物質(zhì)。這些結(jié)果表明,DMBA處理通過提高氧化應(yīng)激,降低線粒體功能,產(chǎn)生過多的熒光物質(zhì)損害卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟。(4)20μM DMBA抑制COC周圍卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展(24 h,2.3 vs.1.4,P0.05),促進(jìn)卵丘的脫落(44 h,1.2 vs.0.9,P0.05),誘導(dǎo)卵丘細(xì)胞DNA損傷,但并不引起卵丘細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果表明20μM DMBA改變卵丘細(xì)胞的狀態(tài)和分子通路,進(jìn)而間接影響卵母細(xì)胞的核質(zhì)成熟。(5)利用孤雌激活評(píng)價(jià)DMBA處理后成熟卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能,結(jié)果表明20μM DMBA處理顯著降低孤雌胚胎的卵裂率(COC,21.7%vs.86.2%,P0.05;DO,28.8%vs.81.4%,P0.05)和囊胚率(COC,0%vs.26.6%,P0.05;DO,0%vs.13.9%,P0.05)。處理組的多數(shù)孤雌胚胎阻滯在1細(xì)胞期(COC,78.3%vs.12.9%,P0.05;DO,71.2%vs.18.6%,P0.05),沒有囊胚形成。染色發(fā)現(xiàn)阻滯的1-cell孤雌胚胎具有1-6個(gè)原核,沒有MⅡ中期的染色體。這些結(jié)果指示DMBA處理成熟期的卵母細(xì)胞抑制成熟后卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能,盡管這些成熟的卵母細(xì)胞可以被激活形成原核。綜上所述,DMBA處理影響豬卵母細(xì)胞的核成熟,胞質(zhì)成熟和核質(zhì)成熟的協(xié)同性,破壞成熟卵母細(xì)胞的后續(xù)發(fā)育潛能。在DMBA誘導(dǎo)的效應(yīng)中,對(duì)卵母細(xì)胞核成熟及其相關(guān)事件的影響是由卵周圍的卵丘體細(xì)胞通過縫隙連接調(diào)控卵母細(xì)胞內(nèi)部的PLC,MAPK,DNA損傷和組蛋白甲基化來實(shí)現(xiàn)的。不管卵丘細(xì)胞是否存在,DMBA都能通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激,破壞線粒體功能和產(chǎn)生熒光物質(zhì)影響胞質(zhì)成熟。本研究的結(jié)果為DMBA影響雌性生殖提供了新的研究信息和思路。
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【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S828

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2383199