【摘要】：資源過度開發(fā)帶來的環(huán)境污染導致生態(tài)環(huán)境急劇惡化,這可能與近年人類生殖能力的急速下降有關。已有的體內/體外實驗結果顯示多環(huán)芳烴家族的多個成員均能引起生殖健康問題。7,12-二甲基苯并蒽是多環(huán)芳烴類化學物質中的一員(7,12-dimethylbenz(a)anthracene,DMBA),能破壞嚙齒類動物卵巢中各發(fā)育階段卵泡。但其對于卵母細胞減數(shù)分裂成熟的影響仍不清楚,尤其是在大動物(豬)模型上仍是空白。卵母細胞減數(shù)分裂成熟包括核成熟,胞質成熟和核質成熟的協(xié)同性三個方面。本研究中,利用豬卵母細胞體外成熟系統(tǒng),我們研究了DMBA對卵母細胞減數(shù)分裂成熟的影響,并試圖解析其影響機制,從而增加人們對環(huán)境污染物影響生殖的了解。主要研究結果如下:(1)不同濃度DMBA(10μM和20μM)成熟培養(yǎng)豬卵丘-卵復合體(Cumulus-oocyte complexes,COCs)和裸卵(cumulus-denuded oocytes,DOs),結果顯示20μM DMBA提高COC組44 h卵母細胞第一極體排出率(88.2%vs.76.4%,P0.05),而10μM DMBA沒有顯著改變(83.0%vs.76.4%,P0.05)。10μM和20μM DMBA不影響裸卵組44 h卵母細胞第一極體排出率(69.7%,73.5%vs.77.1%;P0.05)。進一步剖析COC組核進程發(fā)現(xiàn)20μM DMBA處理顯著升高18 h GVBD率(35.1%vs.19.5%,P0.05),而顯著降低24 h GVBD率(61.3%vs.74.7%,P0.05)。甘珀酸(Carbenoxolone,CBX)抑制COC組的縫隙連接顯著降低20μM DMBA提高的極體排放率(64.1%vs.87.0%,P0.05),但對DO組的極體排出率沒有影響(68.3%vs.71.0%,P0.05)。這些結果表明卵丘細胞可能通過縫隙連接介導DMBA對豬卵的核成熟效應。免疫印跡試驗發(fā)現(xiàn)20μM DMBA顯著升高COC組卵母細胞中的p ERK1/2(T202/Y204)的水平(1.2 vs.1.0,P0.05),但不改變p CDK1(T161)的水平(1.0 vs.1.0,P0.05)。絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路抑制劑U0126降低20μM DMBA誘導的COC組第一極體排出升高效應(24.4%vs.94.2%;P0.05)。磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)信號通路抑制劑U73122也具有類似的效應(80.5%vs.94.2%;P0.05)。但AHR信號通路抑制劑Alpha-NF不能改變DMBA的促第一極體排出效應(89.8%vs.90.7%;P0.05)。這些結果說明,卵丘細胞通過影響COC組豬卵母細胞中的PLC和MAPK信號通路介導20μM DMBA對核成熟的效應。(2)20μM DMBA顯著下調COC組卵母細胞的H3K9me3(0.6 vs.1.0;P0.05)和H3K27me3水平(0.6 vs.1.0;P0.05),顯著上調H3K36me3水平(1.3 vs.1.0;P0.05),使卵母細胞基因組處于相對激活狀態(tài)。RT-q PCR結果顯示20μM DMBA顯著下調G9a(0.8vs.1.0;P0.05)和Eed(0.8 vs.1.0;P0.05)mRNA的豐度。在DO系統(tǒng)中,20μM DMBA不影響卵母細胞中H3K9me3,H3K27me3和H3K36me3的水平。20μM DMBA能顯著增強COC組卵母細胞中的γH2A.X免疫熒光信號(2.9 vs.0.5;P0.05)和蛋白水平(1.3 vs.1.0;P0.05),但在DO系統(tǒng)中并不影響γH2A.X免疫熒光信號(0.6 vs.0.7;P0.05)。Annexin V檢測卵母細胞凋亡發(fā)現(xiàn)20μM DMBA顯著提高COC組卵母細胞的凋亡比例(41.5%vs.13.9%;P0.05),但不影響DO組卵母細胞的早期凋亡(11.3%vs.13.9%;P0.05)。這些結果表明,卵丘細胞介導了DMBA誘導的卵母細胞染色體相關事件,以及其下游事件的改變效應,如組蛋白修飾狀態(tài),DNA雙鏈斷裂損傷和其可能導致的早期凋亡事件。(3)對于卵母細胞胞質成熟,20μM DMBA顯著提高COC和DO組卵母細胞內的氧化應激水平(COC,7.6 vs.1.0,P0.05;DO,13.8 vs.1.0,P0.05),顯著降低線粒體膜電位水平(COC,0.7 vs.1.0,P0.05;DO,0.9 vs.1.0,P0.05)。有趣的是我們還發(fā)現(xiàn)DMBA處理誘導COC和DO組卵母細胞(12,18,24,44 h)胞質產(chǎn)生藍色熒光物質。這些結果表明,DMBA處理通過提高氧化應激,降低線粒體功能,產(chǎn)生過多的熒光物質損害卵母細胞胞質成熟。(4)20μM DMBA抑制COC周圍卵丘細胞的擴展(24 h,2.3 vs.1.4,P0.05),促進卵丘的脫落(44 h,1.2 vs.0.9,P0.05),誘導卵丘細胞DNA損傷,但并不引起卵丘細胞凋亡。這些結果表明20μM DMBA改變卵丘細胞的狀態(tài)和分子通路,進而間接影響卵母細胞的核質成熟。(5)利用孤雌激活評價DMBA處理后成熟卵母細胞的發(fā)育潛能,結果表明20μM DMBA處理顯著降低孤雌胚胎的卵裂率(COC,21.7%vs.86.2%,P0.05;DO,28.8%vs.81.4%,P0.05)和囊胚率(COC,0%vs.26.6%,P0.05;DO,0%vs.13.9%,P0.05)。處理組的多數(shù)孤雌胚胎阻滯在1細胞期(COC,78.3%vs.12.9%,P0.05;DO,71.2%vs.18.6%,P0.05),沒有囊胚形成。染色發(fā)現(xiàn)阻滯的1-cell孤雌胚胎具有1-6個原核,沒有MⅡ中期的染色體。這些結果指示DMBA處理成熟期的卵母細胞抑制成熟后卵母細胞的發(fā)育潛能,盡管這些成熟的卵母細胞可以被激活形成原核。綜上所述,DMBA處理影響豬卵母細胞的核成熟,胞質成熟和核質成熟的協(xié)同性,破壞成熟卵母細胞的后續(xù)發(fā)育潛能。在DMBA誘導的效應中,對卵母細胞核成熟及其相關事件的影響是由卵周圍的卵丘體細胞通過縫隙連接調控卵母細胞內部的PLC,MAPK,DNA損傷和組蛋白甲基化來實現(xiàn)的。不管卵丘細胞是否存在,DMBA都能通過誘導氧化應激,破壞線粒體功能和產(chǎn)生熒光物質影響胞質成熟。本研究的結果為DMBA影響雌性生殖提供了新的研究信息和思路。
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【學位授予單位】：東北農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S828

【參考文獻】

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本文編號：2383199