【摘要】：當(dāng)細(xì)胞暴露于各種環(huán)境應(yīng)激條件下,如亞砷酸鹽,缺氧和熱休克時(shí),細(xì)胞終止蛋白翻譯,在細(xì)胞質(zhì)中形成儲(chǔ)存mRNA的顆粒,稱為應(yīng)激顆粒(stress granule,SG)。SG是在應(yīng)激條件下從解聚的多核糖體儲(chǔ)存位點(diǎn)釋放的mRNA,對(duì)選擇性翻譯是所必需的。當(dāng)應(yīng)激條件消失時(shí),應(yīng)激刺激的細(xì)胞內(nèi)損傷得到修復(fù),例如DNA損傷和錯(cuò)誤折疊蛋白的積累。RNA結(jié)合蛋白T細(xì)胞內(nèi)部抗原-1 (TIA-1)和GTP酶激活蛋白SH3功能區(qū)結(jié)合蛋白1 (G3BP1)是參與SG形成的重要組件。作為對(duì)環(huán)境應(yīng)激的一種保守應(yīng)答反應(yīng),SG存在于各種物種中。然而,在雞細(xì)胞中SG形成以及TIA-1/G3BP1在雞SG裝配中的作用還沒(méi)有被闡明。本研究重點(diǎn)將對(duì)雞TIA-1/G3BP1的功能及其在病毒復(fù)制中的作用進(jìn)行研究。TIA-1在調(diào)節(jié)人類細(xì)胞中前mRNA剪接,mRNA翻譯和SG形成中發(fā)揮作用。在本研究中,我們克隆雞TIA-1 (cTIA-1),結(jié)果表明外源轉(zhuǎn)染cTIA-1促進(jìn)人和雞細(xì)胞中經(jīng)典SGs的形成。具有氨基末端GFP標(biāo)簽(ntGFP-cPRD)或Flag標(biāo)簽(Flag-cPRD)的cTIA-1朊蛋白相關(guān)結(jié)構(gòu)域cPRD的過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)典型的SG的產(chǎn)生,說(shuō)明cPRD參與了SG的聚集。然而,羧基末端GFP標(biāo)簽(ctGFP-cPRD) cPRD誘導(dǎo)明顯較大的細(xì)胞質(zhì)顆粒,并且不與內(nèi)源性G3BP1共定位,CHX處理后仍保持穩(wěn)定不降解,這些結(jié)果表明這些顆粒不是典型的SGs,ctGFP標(biāo)簽影響cPRD定位。在外界環(huán)境應(yīng)激下,內(nèi)源性cTIA-1被募集到的雞細(xì)胞的SG中,在熱休克處理下,雞心臟中出現(xiàn)明顯SG顆粒。以上結(jié)果表明:cTIA-1在雞細(xì)胞中的經(jīng)典SG形成中起作用,cPRD在SG聚集過(guò)程中發(fā)揮重要作用。G3BP1是SGs的重要組件,能夠啟動(dòng)組裝SGs形成多聚體。為掌握G3BP1在如何作用于雞細(xì)胞中SG形成,以及雞G3BP1 (cG3BP1)在新城疫病毒(NDV)感染誘導(dǎo)SG形成過(guò)程中的作用,用NDV感染HeLa細(xì)胞,免疫熒光檢測(cè)內(nèi)源性G3BP1的定位,結(jié)果表明G3BP1呈現(xiàn)典型的點(diǎn)狀熒光,但不與病毒P蛋白共定位。將雞G3BP1分別轉(zhuǎn)染至HeLa, DF-1和CEF后,以不同應(yīng)激處理之后均能在細(xì)胞中觀察到SG。外源轉(zhuǎn)染cG3BP1和各分段結(jié)構(gòu)域后以不同應(yīng)激處理之后觀察與內(nèi)源性SG標(biāo)志物共定位現(xiàn)象,結(jié)果發(fā)現(xiàn)G3BP1的A結(jié)構(gòu)域(NTF2樣結(jié)構(gòu)域)不能被招募到SGs中,并且抑制原有SGs的形成,D區(qū)為RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,單獨(dú)表達(dá)D區(qū)能夠誘導(dǎo)SG形成,說(shuō)明cG3BP1的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)奂陵P(guān)重要。最后轉(zhuǎn)染G3BP1之后感染NDV,以Western-blot和TCID50檢測(cè)病毒復(fù)制情況。結(jié)果顯示:G3BP1過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)病毒細(xì)胞中病毒蛋白的表達(dá)以及上清中的病毒滴度,說(shuō)明SG在NDV復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)作用。雞TIA-1和G3BP1在雞細(xì)胞SG形成過(guò)程中至關(guān)重要,雞細(xì)胞中G3BP1介導(dǎo)的SG能夠促進(jìn)NDV復(fù)制,這為進(jìn)一步研究NDV和禽源細(xì)胞互作奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:When cells are exposed to various environmental stresses, such as arsenite, anoxia and heat shock, cell termination proteins translate into particles that store mRNA in the cytoplasm, known as stress particles (stress granule, SG). SG is the release of mRNA, from depolymerized polyribosomal storage sites under stress conditions, which is necessary for selective translation. When the stress condition disappeared, the stress-stimulated intracellular damage was repaired. For example, DNA damage and the accumulation of misfolded proteins. RNA binding protein T cell internal antigen 1 (TIA-1) and GTP enzyme activating protein SH3 binding protein 1 (G3BP1) are important components involved in the formation of SG. As a conservative response to environmental stress, SG exists in a variety of species. However, the formation of SG in chicken cells and the role of TIA-1/G3BP1 in chicken SG assembly have not been clarified. This study focuses on the function of chicken TIA-1/G3BP1 and its role in viral replication. TIA-1 plays a role in regulating premRNA splicing, mRNA translation and SG formation in human cells. In this study, we cloned chicken TIA-1 (cTIA-1). The results showed that exogenous transfection of cTIA-1 promoted the formation of classical SGs in human and chicken cells. The overexpression of cTIA-1 prion protein related domain cPRD with amino terminal GFP tag (ntGFP-cPRD) or Flag tag (Flag-cPRD) induces the production of typical SG, indicating that cPRD is involved in the aggregation of SG. However, the carboxyl terminal GFP label (ctGFP-cPRD) cPRD induced significantly larger cytoplasmic particles and did not co-locate with endogenous G3BP1, and CHX remained stable and non-degradable after treatment with CHX. These results indicated that these particles were not typical SGs,. CtGFP tags affect cPRD positioning. In the SG of chicken cells raised by endogenous cTIA-1 under external environmental stress, obvious SG granules appeared in chicken heart under heat shock treatment. These results indicate that cTIA-1 plays an important role in the formation of classical SG in chicken cells and cPRD plays an important role in the aggregation of SG. G3BP1 is an important component of SGs and can initiate the assembly of SGs to form a polymer. In order to understand the role of G3BP1 in the formation of SG in chicken cells and the role of G3BP1 (cG3BP1) in SG formation induced by Newcastle disease virus (NDV) infection, HeLa cells were infected with NDV and the localization of endogenous G3BP1 was detected by immunofluorescence. The results showed that G3BP1 showed typical dot fluorescence, but not co-located with virus P protein. After transfection of chicken G3BP1 into HeLa, DF-1 and CEF, SG. could be observed in the cells after different stress treatments. After exogenous transfection of cG3BP1 and each segmental domain, the co-localization with endogenous SG markers was observed after different stress treatments. The results showed that the A domain (NTF2 like domain) of G3BP1 could not be recruited into SGs and inhibited the formation of original SGs. The expression of D region alone can induce the formation of SG, indicating that the RNA binding domain of cG3BP1 plays an important role in aggregation. Finally, after transfection of G3BP1, NDV, was infected with Western-blot and TCID50 to detect the replication of the virus. The results showed that the overexpression of G3BP1 could enhance the expression of viral protein and the titer of virus in the supernatant, indicating that SG played a promoting role in the process of NDV replication. Chicken TIA-1 and G3BP1 play an important role in the formation of chicken cell SG. SG mediated by G3BP1 in chicken cells can promote NDV replication, which lays a foundation for further study on the interaction between NDV and avian origin cells.
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S831

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本文編號(hào)：2375895