【摘要】：豬鏈球菌作為重要的人畜共患病原菌,自報(bào)道以來(lái)已引起世界范圍的廣泛流行。最初大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物能夠有效治療豬鏈球菌病,但目前豬鏈球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)的耐藥問(wèn)題已較為嚴(yán)重。耐藥機(jī)制對(duì)宿主菌適應(yīng)性的影響決定著細(xì)菌耐藥性的傳播速度,為有效控制大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥豬鏈球菌的產(chǎn)生和流行,我們有必要對(duì)其耐藥性及適應(yīng)性進(jìn)行研究。本文分別研究了耐藥基因及靶位突變對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥株適應(yīng)性的影響,旨在為有效控制耐藥菌的擴(kuò)散和流行提供理論依據(jù)。一、耐藥基因mefA/msrD對(duì)宿主菌的體外適應(yīng)性影響首先對(duì)攜帶mefA/msrD基因的耐藥菌株及相關(guān)參照敏感菌株進(jìn)行生長(zhǎng)曲線測(cè)定,并比較生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù),通過(guò)體外競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)比較耐藥菌株與敏感菌株的相對(duì)適應(yīng)性;而后通過(guò)構(gòu)建mefA相關(guān)載體并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α,探究mefA對(duì)宿主菌耐藥性及適應(yīng)性的影響;最后利用pSET4s構(gòu)建溫敏性自殺重組質(zhì)粒,對(duì)耐藥豬鏈球菌NJ-2中的msrD基因進(jìn)行定點(diǎn)無(wú)痕缺失,以期構(gòu)建msrD基因缺失突變株來(lái)研究msrD對(duì)宿主菌適應(yīng)性的影響。結(jié)果顯示體外競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)測(cè)得攜帶外排泵的各耐藥菌株與親本株體外適應(yīng)性無(wú)顯著差異;mefA基因成功轉(zhuǎn)化入DH5α后,其對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的敏感性會(huì)下降,但未發(fā)現(xiàn)可檢測(cè)到的適應(yīng)性代價(jià);通過(guò)融合PCR方法將msrD基因的上下游同源臂連接在一起后,成功構(gòu)建得到同源重組質(zhì)粒pSET4s::msrDL-mrDR。將該同源重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入受試菌株后,未能夠成功篩選到發(fā)生同源重組的陽(yáng)性缺失菌株,推測(cè)可能是msrD基因?qū)κ茉嚲甑倪m應(yīng)性起到關(guān)鍵作用。二、甲基化酶基因ermB對(duì)宿主菌的體外適應(yīng)性影響首先對(duì)臨床分離的豬鏈球菌大環(huán)內(nèi)醋類(lèi)耐藥株的適應(yīng)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。PCR檢測(cè)受試菌株中的甲基化酶基因ermB,對(duì)攜帶ermB基因的耐藥菌株及參照敏感菌株進(jìn)行了生長(zhǎng)曲線的測(cè)定,并將計(jì)算得到的各耐藥菌株與敏感菌株的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行比較;最后通過(guò)體外競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)比較耐藥菌株與敏感菌株的相對(duì)適應(yīng)性,而后構(gòu)建ermB耐藥基因相關(guān)載體并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌,初步探究ermB對(duì)宿主菌耐藥性及適應(yīng)性的影響。結(jié)果顯示:耐藥菌株HB1004、HB1010及SC05017相對(duì)兩株敏感菌株BA853和SS2-1的體外適應(yīng)性差異均不顯著,但JS07002與兩株參照敏感菌株相比均表現(xiàn)為體外適應(yīng)性較低。ermB基因在大腸桿菌中會(huì)顯著提高其對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的耐藥性,同時(shí)該基因會(huì)顯著降低宿主大腸桿菌的體外適應(yīng)性。三、藥物作用靶位突變對(duì)耐藥豬鏈球菌適應(yīng)性的影響挑選四株不同來(lái)源的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)敏感豬鏈球菌作為研究對(duì)象,用紅霉素、阿奇霉素及泰樂(lè)菌素分別對(duì)受試敏感菌株進(jìn)行體外誘導(dǎo)耐藥;對(duì)獲得的高水平耐藥菌株的耐藥表型和基因突變型進(jìn)行檢測(cè);然后分析高水平耐藥菌的體外及體內(nèi)適應(yīng)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn):誘導(dǎo)所得的所有高水平耐藥菌的23S rRNA都存在位點(diǎn)突變,部分菌株存在L4及L22的位點(diǎn)突變;對(duì)所有的親本株和耐藥菌株進(jìn)行體內(nèi)及體外適應(yīng)性分析發(fā)現(xiàn),發(fā)生突變的高水平耐藥菌的適應(yīng)性與其親本株相比大多數(shù)出現(xiàn)適應(yīng)性下降僅A2059位點(diǎn)突變無(wú)適應(yīng)性代價(jià),甚至?xí)岣咄蛔兙赀m應(yīng)性。綜上所述,攜帶mefA-msrD的豬鏈球菌與參照敏感菌株的體外競(jìng)爭(zhēng)力無(wú)顯著差異,mefA可介導(dǎo)DH5α對(duì)14-,15-元大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素低度耐藥,且無(wú)適應(yīng)性代價(jià);攜帶ermB的豬鏈球菌JS07002與參照敏感菌株相比體外競(jìng)爭(zhēng)力較低,ermB基因在顯著提高DH5α對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物耐藥性的同時(shí)會(huì)降低其體外適應(yīng)性。體外誘導(dǎo)得到的高水平大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥豬鏈球菌存在23S rRNA及核糖體蛋白L4、L22的結(jié)構(gòu)關(guān)鍵位點(diǎn)的突變。在23S rRNA基因的各突變位點(diǎn)中,僅A2059位點(diǎn)突變無(wú)適應(yīng)性代價(jià),甚至?xí)岣咄蛔兙甑捏w內(nèi)適應(yīng)性,但G2057、A2062位點(diǎn)的突變會(huì)產(chǎn)生高適應(yīng)性代價(jià)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S852.611

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2375227