發(fā)布時(shí)間：2018-12-11 21:33

【摘要】：目的:腸出血性大腸桿菌O157:H7(EHEC O157:H7)是全球食源性疾病的主要病原之一,自從1982年被報(bào)道作為一種腸道致病菌以來,已經(jīng)在我國以及世界范圍內(nèi)引起多次暴發(fā)流行,散發(fā)病例更是經(jīng)常見諸各種臨床雜志和報(bào)道。EHEC O157:H7感染對人類健康和食品行業(yè)都帶來了明顯的經(jīng)濟(jì)損失。由于尚未有預(yù)防或者特殊的治療方式,了解EHEC O157:H7如何感染宿主及其致病方式對于避免EHEC O157:H7的暴發(fā)和改進(jìn)治療方式將有重要意義,對有針對性地開發(fā)治療創(chuàng)新藥物、設(shè)計(jì)治療方案、研制有效疫苗、制定預(yù)防控制措施具有重要的理論指導(dǎo)作用。大腸桿菌引起感染主要取決于其毒力因子,目前研究報(bào)道較多的有緊密黏附素(Intimin)及緊密黏附素受體(Tir)和III型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白。EHEC O157:H7通過III型分泌系統(tǒng)將其毒力蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主細(xì)胞內(nèi),與宿主細(xì)胞發(fā)生作用,介導(dǎo)宿主肌動(dòng)蛋白聚集,引起粘附與擦拭(A/E)損傷。但是此過程中具體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路至今尚不清楚。了解引起粘膜擦拭損傷相關(guān)的蛋白,對闡明EHEC O157:H7的致病機(jī)制有重要的意義。本研究的目的是對預(yù)測的EHEC O157:H7 III型分泌系統(tǒng)的分泌蛋白進(jìn)行逐級篩選鑒定,對篩選出的Z2322、Z2340等7個(gè)蛋白基因進(jìn)行克隆表達(dá)及純化,并進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn),分析成功表達(dá)純化的Z2322、Z2340等5個(gè)蛋白在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答,進(jìn)一步明確其刺激小鼠產(chǎn)生的免疫應(yīng)答類型(Th1/Th2),為研究Z2322、Z2340等5個(gè)蛋白在EHEC O157:H7的致病機(jī)制中的作用以及為新型疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。方法:以EHEC O157:H7 EDL933菌株基因組為基礎(chǔ),用LipoP等七個(gè)在線預(yù)測軟件預(yù)測Z2322、Z2340等7個(gè)蛋白是否含有信號肽、是否可能為內(nèi)膜蛋白或者外膜蛋白、預(yù)測其亞細(xì)胞定位并分析其核苷酸序列的保守性。以EHEC O157:H7 EDL933菌株基因組為模板對Z2322、Z2340等7個(gè)蛋白的基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增,同時(shí)引入酶切位點(diǎn)BamHI和Xho I,目的基因雙酶切后的回收產(chǎn)物分別與pET-22b(+)等四個(gè)表達(dá)載體相連,轉(zhuǎn)化到E.Coli BL21(DE3)中,在IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)融合蛋白,并對融合蛋白的表達(dá)形式進(jìn)行鑒定。將成功表達(dá)的蛋白用Ni親和柱進(jìn)行純化并制備鼠抗蛋白血清,采用ELISA方法檢測蛋白的免疫原性。將免疫的小鼠分別在21、28、35、42天尾靜脈采血收集血清,ELISA檢測IgG抗體及其亞型(IgG1、IgG2a、IgG3)的效價(jià),分析其刺激小鼠產(chǎn)生的免疫應(yīng)答類型(Th1/Th2)。將免疫后的小鼠用EHEC O157:H7 EDL933株進(jìn)行攻毒,檢測蛋白對小鼠的保護(hù)性。在攻毒后每日采集小鼠糞便檢測其活菌排菌量,確定蛋白對細(xì)菌定植的影響。結(jié)果:1.通過LipoP、Lipo、SignalP 4.1軟件預(yù)測,Z2322、Z2340、Z2354、Z2691、Z3074、Z3322和Z3955蛋白不存在信號肽。經(jīng)預(yù)測軟件TmHmm和Bomp分析,這些蛋白不存在α-螺旋和β-桶狀結(jié)構(gòu)。亞細(xì)胞定位軟件PSORTb 3.0.2和CELLO v.2.5分析發(fā)現(xiàn),這些蛋白可能分泌至細(xì)胞外,且通過BLAST比對發(fā)現(xiàn)這些蛋白核苷酸序列保守性較高。2.成功克隆Z2322、Z2340等七個(gè)預(yù)測蛋白基因片段并構(gòu)建出重組質(zhì)粒,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),成功表達(dá)出E.coli BL21-pET-28a-Z2691、E.coli BL21-pET-30a-Z2322等10個(gè)重組蛋白。其中E.coli BL21-pET-28a-Z2691等5個(gè)蛋白在上清中表達(dá),為可溶性蛋白;E.coli BL21-pET-30a-Z2322等5個(gè)蛋白以包涵體的形式表達(dá)在沉淀中。3.用不同的方法分別純化可溶性蛋白和包涵體蛋白,經(jīng)SDS-PAGE分析蛋白分子量大小與預(yù)期一致。ELISA方法檢測Z2322、Z2340、Z2691、Z3322和Z3955抗血清的效價(jià),Z2340、Z2691和Z3955為62500EU,Z2322為12500EU,Z3322為2500EU。Z2322、Z2340、Z2691、Z3322能刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生的以Th2型免疫占優(yōu)勢的免疫應(yīng)答,Z3955能刺激機(jī)體產(chǎn)生以Th1型免疫占優(yōu)勢的免疫應(yīng)答。4.免疫保護(hù)性實(shí)驗(yàn)顯示,Z2340、Z2691和Z3955、Z2322能降低小鼠死亡率對其產(chǎn)生較好的保護(hù)作用,Z3322能延長小鼠的存活時(shí)間,對其產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。這與ELISA方法檢測各蛋白刺激小鼠產(chǎn)生的抗血清效價(jià)結(jié)果一致。活菌排菌量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Z2322、Z2340、Z2691、Z3955蛋白免疫組分別在攻毒后第6d、7d、9d、9d后檢測不到O157:H7活菌,Z3322蛋白免疫組活菌排菌量少于對照組,說明Z2322、Z2340、Z2691、Z3955能縮短EHEC O157:H7在小鼠體內(nèi)的存活時(shí)間,減少食物鏈的污染,Z3322縮短EHEC O157:H7在小鼠體內(nèi)的存活時(shí)間的作用則不明顯。
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【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.61

【參考文獻(xiàn)】

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1 蔡冉;周潔;許桂麗;徐悅s，

本文編號：2373256