【摘要】：性早熟在人類上表現(xiàn)為病理狀態(tài),而在家禽生產(chǎn)上則是一個具有重要經(jīng)濟(jì)價值的性狀。我國地方雞品種資源的早熟特性十分明顯,開展雞性成熟調(diào)控機(jī)制研究,對于高產(chǎn)蛋雞和優(yōu)質(zhì)肉雞育種具有重要意義。同時,雞作為重要的模式生物,其早熟性相關(guān)研究也可為人類性早熟疾病臨床診斷、治療提供科學(xué)依據(jù)。性成熟啟動是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程,決定性成熟啟動的關(guān)鍵性事件是下丘腦GnRH脈沖式釋放增加。近年來研究發(fā)現(xiàn),諸多功能基因和調(diào)節(jié)因子參與了性成熟啟動,性成熟啟動基因的轉(zhuǎn)錄抑制可能起到了重要作用,防止了性成熟的過早發(fā)生;模式生物和哺乳動物(包括人類)發(fā)育時機(jī)研究提示miRNA和性成熟啟動之間有潛在聯(lián)系;進(jìn)入血液循環(huán)的外泌體所裝載的miRNA能在血清(漿)中穩(wěn)定存在,并且其拷貝數(shù)變化能反映機(jī)體生理和病理狀態(tài)改變,是一種新型生物標(biāo)志物。本論文選取早熟地方雞品種文昌雞為實(shí)驗(yàn)素材,主要開展了以下幾個方面的研究:(1)測定不同發(fā)育時期文昌雞母雞雞冠、性腺組織的發(fā)育性變化和血清LH濃度變化,度量文昌雞母雞的性成熟啟動時機(jī),為構(gòu)建性成熟啟動前、后高通量測序文庫提供基礎(chǔ)。(2)利用qRT-PCR技術(shù)檢測了c-Myc/LIN28/let-7通路、POK/PcG/TRG通路部分功能基因在性成熟啟動前、后文昌雞下丘腦中的表達(dá)變化規(guī)律。(3)利用Solexa高通量測序技術(shù)檢測了雞性成熟啟動前、后下丘腦中miRNA表達(dá)譜,結(jié)合生物信息學(xué)分析,探討miRNA在雞性成熟啟動調(diào)控中的作用。(4)利用Solexa高通量測序技術(shù)檢測了雞性成熟啟動前、后血清(漿)中miRNA表達(dá)譜,篩選差異表達(dá)miRNA,并利用qRT-PCR技術(shù)檢測候選miRNA在性成熟啟動及進(jìn)程中的表達(dá)規(guī)律,建立雞性成熟啟動度量特異性循環(huán)miRNA標(biāo)記檢測技術(shù)。綜合本論文的研究結(jié)果,主要得出以下結(jié)論:(1)性成熟啟動時機(jī)度量在發(fā)育早期,文昌雞雞性腺組織發(fā)育緩慢,卵泡保持原始狀態(tài),這一過程約持續(xù)12周。12周齡后,性腺組織進(jìn)入快速發(fā)育期,13周齡母雞的卵巢重量(1.35g)和輸卵管長度(15.68cm)與12周齡測量值(0.60g、7.16cm)相比,分別增加了125%和120%,同時出現(xiàn)等級前小白卵泡(SWF,直徑1.0～2.0mm)或大白卵泡(LWF,直徑3.0～5.0mm)。LH水平的增加與性腺組織的快速發(fā)育相一致,LH水平在13周齡顯著增加(P0.01),并在14～15周齡達(dá)到峰值,至開產(chǎn)后下降至較低水平。確定了13周齡為文昌雞母雞的性成熟啟動關(guān)鍵轉(zhuǎn)折點(diǎn),這為構(gòu)建性成熟啟動前、后高通量測序文庫提供了前提。(2)性成熟啟動調(diào)節(jié)通路功能基因表達(dá)規(guī)律qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)c-Myc、LIN28B基因在文昌雞性成熟啟動關(guān)鍵時機(jī)(12周齡至13周齡)下丘腦組織中的表達(dá)水平顯著降低(P0.05,P0.01),且c-Myc基因的低表達(dá)能夠持續(xù)到開產(chǎn),而LIN28B基因表達(dá)水平在開產(chǎn)前(15周齡)又恢復(fù)至較高水平;與之相對應(yīng)的是,Solexa高通量檢測發(fā)現(xiàn)性成熟啟動后let-7a、let-7b和let-7g表達(dá)水平升高。BCL6、ZBTB7A基因在性成熟啟動前期下丘腦中的表達(dá)水平較低,性成熟啟動后BCL6基因表達(dá)水平顯著升高(P0.01),ZBTB7A基因表達(dá)水平雖有所升高,但與前期相比差異并不顯著(P0.05),其表達(dá)水平的顯著性變化(P0.01)發(fā)生在15周齡,且在開產(chǎn)后仍維持較高水平。YY1、EED基因在性成熟啟動前期下丘腦中的表達(dá)水平較高,性成熟啟動后表達(dá)水平顯著降低(P0.01),且這種低水平表達(dá)僅維持2～3周,15周齡后又恢復(fù)至較高水平,并持續(xù)至開產(chǎn)。Oct-1基因在文昌雞性成熟啟動前期下丘腦中的表達(dá)水平較低,性成熟啟動后表達(dá)水平顯著升高(P0.01),且至開產(chǎn)仍保持較高水平,而TT1基因表達(dá)水平在性成熟啟動后顯著降低(P0.01)。總體上,研究結(jié)果支持基于哺乳動物數(shù)據(jù)構(gòu)建的多層次等級基因調(diào)節(jié)通路模式,即c-Myc(↓)→LIN28(↓)-|let-7(↑),POK(↑)-|PcG(↓)-|TRG(↑)(→表示促進(jìn)作用,-|表示抑制作用),進(jìn)一步證實(shí)了該調(diào)控通路與性成熟啟動調(diào)節(jié)相關(guān)。推測通路調(diào)節(jié)功能在脊椎動物、哺乳動物(包括人類)進(jìn)化上是保守的,多層次等級基因轉(zhuǎn)錄抑制作用可能防止了性成熟的過早發(fā)生。(3)性成熟啟動前后下丘腦miRNA表達(dá)譜通過高通量測序,在雞下丘腦中鑒定出374個已知miRNA、46個新miRNA,144個已知miRNA(reads10)的表達(dá)水平在性成熟啟動前后發(fā)生了顯著改變(P0.05)。5個差異表達(dá)miRNA被qRT-PCR方法進(jìn)一步驗(yàn)證。15個差異最顯著miRNA(| log2(fold-change)|2.0,P0.01)預(yù)測到2013個靶基因,其中7個時鐘基因Per2、Bmal1/2、Clock、Cry1/2和Star被差異miRNA靶向多次,qRT-PCR檢測表明這些時鐘基因的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平在性成熟啟動后下丘腦中顯著升高(P0.01)。GO富集和KEGG調(diào)節(jié)通路分析結(jié)果表明,這些差異表達(dá)miRNA在性成熟啟動轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮了重要作用。表明miRNA是參與雞性成熟啟動新的調(diào)節(jié)因子。鑒于miRNA功能的保守性,該研究結(jié)果將為深入開展動物(包括人類)性成熟的分子調(diào)控機(jī)制研究提供新的理論依據(jù)。(4)性成熟啟動前后循環(huán)miRNA表達(dá)譜和循環(huán)miRNA標(biāo)記通過高通量測序,在血清、血漿中鑒定出共表達(dá)miRNA 192個,血清中特異性表達(dá)miRNA 1個,血清中特異性表達(dá)miRNA4個,新發(fā)現(xiàn)miRNA 19個(reads10)。針對同一miRNA,在相同發(fā)育時期血清、血漿中的表達(dá)豐度基本一致。性成熟啟動前、后血清中差異表達(dá)miRNA(P0.05)有130個,其中表達(dá)上調(diào)的有68個,下調(diào)的有62個。40個差異表達(dá)miRNA(| log2(fold-change)丨1.0,P0.01)預(yù)測到4829個差異表達(dá)基因。GO富集和KEGG調(diào)節(jié)通路分析結(jié)果表明,這些差異表達(dá)miRNA主要參與蛋白水解、卵母細(xì)胞分裂、MAPK信號傳導(dǎo)及基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄等通路。qRT-PCR檢測結(jié)果表明,let-7a、miR-29c-3p、miR-217-5p、miR-375、miR-215-5p、miR-155、miR-9-5p、miR-19b-3p和miR-133a-3p等9個候選miRNA在性成熟啟動時機(jī)(12至13周齡轉(zhuǎn)變)表達(dá)變化趨勢與Solexa測序結(jié)果基本一致。候選miRNA在性成熟啟動前期血清中表達(dá)水平基本一致,就性成熟啟動時機(jī)(12至13周齡轉(zhuǎn)變)而言,miR-29c-3p(p=0.000)、miR-375(p=0.002)、miR-215-5p(p=0.013)、miR-9-5p(p=0.034)、miR-19b-3p(p=0.008)、miR-133a-3p(p=0.006)和let-7a(p=0.002)的表達(dá)水平顯著升高,miR-217-5p(p=0.112)和miR-155(p=0.174)的表達(dá)水平并未發(fā)生顯著性變化,基于這7個候選miRNAs組成的特異性新型標(biāo)記可用于文昌雞性成熟啟動時機(jī)的精確度量。鑒于miRNA功能的保守性,這些循環(huán)miRNA標(biāo)記可以為其它動物性成熟啟動度量及人類性早熟診斷提供借鑒。
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【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S831
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本文編號：2373149