【摘要】：旨在建立能穩(wěn)定表達(dá)豬GM-CSF的細(xì)胞系。本研究利用NCBI已公布豬GM-CSF基因序列設(shè)計(jì)引物,采用RT-PCR法擴(kuò)增出豬GM-CSF開放閱讀框(ORF)。發(fā)現(xiàn)其長435bp,編碼144個(gè)核苷酸的蛋白。該蛋白分子質(zhì)量為16.3ku,等電點(diǎn)為7.15。與綿羊、馬、貓、牛、狗和人的同源性分別為77.1%、73.6%、72.2%、71.5%、71.3%和70.8%。通過EcoR I和BamH I酶切后,將GM-CSF基因插入pIRES2-EGFP載體中,構(gòu)建出pIRES2-EGFP-pGM-CSF重組質(zhì)粒。該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染豬腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2)后,G418篩選陽性細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后24h,熒光定量PCR可見GM-CSF mRNA表達(dá)量較對照組及空載體組細(xì)胞顯著升高(P0.01),熒光顯微鏡下亦可見大量綠色熒光表達(dá)。該細(xì)胞系在含有G418的培養(yǎng)液中連續(xù)傳代30次,仍可見GM-CSF基因和蛋白水平的高表達(dá)。本研究成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-pGM-CSF和能穩(wěn)定表達(dá)豬GM-CSF的細(xì)胞系。
[Abstract]:The aim of this study was to establish a cell line capable of stably expressing porcine GM-CSF. In this study, using NCBI published porcine GM-CSF gene sequence design primers, using RT-PCR method to amplify porcine GM-CSF open reading frame (ORF). The protein encoding 144 nucleotides was found to be 435 BP long. The molecular weight of the protein is 16.3ku.The isoelectric point is 7.15. The homology with sheep, horse, cat, cattle, dog and man was 77.1% and 73.6%, 71.53% and 70.8%, respectively. After digested with EcoR I and BamH I, the GM-CSF gene was inserted into pIRES2-EGFP vector to construct pIRES2-EGFP-pGM-CSF recombinant plasmid. After the recombinant plasmid was transfected into porcine intestinal epithelial cells (IPEC-J2), positive cells were screened by G418. At 24 h after transfection, the expression of GM-CSF mRNA was significantly higher in PCR than that in control group and empty vector group (P0.01), and a large amount of green fluorescent expression was also observed under fluorescence microscope. The cell line was subcultured for 30 times in the medium containing G418, and the high expression of GM-CSF gene and protein was still observed. In this study, the eukaryotic expression vector pIRES2-EGFP-pGM-CSF and the cell line which can stably express porcine GM-CSF were successfully constructed.
【作者單位】： 桂林醫(yī)學(xué)院;廣東海洋大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系;廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系;
【基金】：國家自然科學(xué)基金(31101862;31472243)
【分類號(hào)】：Q78;S828

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本文編號(hào)：2371418