發(fā)布時間：2018-12-10 12:03

【摘要】：抗病育種能夠提高豬的抗病力,對養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展有著非常重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)豬對豬呼吸與繁殖綜合征病毒(PRRSV)的抗病力在不同豬種及不同個體間差異顯著。豬干擾素γ誘導(dǎo)蛋白30(IFI30),能夠在專職抗原遞呈細(xì)胞中組成性表達(dá),在其他細(xì)胞中可被IFN-γ等一些炎癥因子誘導(dǎo)表達(dá)或表達(dá)量上調(diào)。其主要功能是催化蛋白質(zhì)二硫鍵的還原。其在Ⅱ類MHC限制性抗原加工遞呈過程中起關(guān)鍵性作用。有研究表明IFI30的表達(dá)情況對機(jī)體抗病毒免疫、腫瘤免疫以及應(yīng)答狀態(tài)有影響。前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)豬感染不同劑量的PRRSV時,豬肺巨噬細(xì)胞(PAMs)中IFI30的表達(dá)量發(fā)生變化,本研究的主要目的是探討豬IFI30對PRRSV在體外細(xì)胞中的增殖以及對感染宿主細(xì)胞的影響。本研究首先從采取的豬肺臟組織中擴(kuò)增出IFI30中長度741bp的CDS區(qū),將其克隆到帶有紅色熒光的真核表達(dá)p EF1a-IRES-Ds Red-Express2上,構(gòu)建出p EF1a-IRES-Ds Red-IFI30表達(dá)載體并將其轉(zhuǎn)染到對PRRSV敏感的Marc145細(xì)胞和豬睪丸細(xì)胞(ST細(xì)胞)中,通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染率以及q RT-PCR和Western Blot驗(yàn)證構(gòu)建的表達(dá)載體,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在Marc145細(xì)胞和ST細(xì)胞中IFI30載體的轉(zhuǎn)染率達(dá)到80%以上,轉(zhuǎn)染表達(dá)載體后的IFI30的m RNA水平和蛋白表達(dá)量都顯著高于對照組(P0.01)。其次,將p EF1a-IRES-Ds Red-IFI30表達(dá)載體以及空載體轉(zhuǎn)染進(jìn)Marc145細(xì)胞中,24小時后轉(zhuǎn)染率達(dá)到80%~90%,然后接種1MOI的PRRSV,24小時后搜集細(xì)胞上清液,提取病毒RNA,進(jìn)行絕對熒光定量PCR檢測病毒RNA水平的變化,并且提取病毒總蛋白,Western Blot檢測病毒M蛋白的表達(dá)水平。用流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙染方法檢測Marc145細(xì)胞的凋亡率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):豬IFI30在Marc145細(xì)胞中表達(dá)時,PRRSV在宿主細(xì)胞中的拷貝數(shù)顯著低于空載組和對照組(p0.01),PRRSV的M蛋白的表達(dá)水平也顯著低于空載組和對照組(p0.01)。流式細(xì)胞術(shù)檢測豬IFI30表達(dá)組的細(xì)胞凋亡率(20.60%)顯著低于轉(zhuǎn)染空載組(66.0%)和對照組(64.66%)的凋亡率(p0.01)。最后,我們將豬IFI30的表達(dá)載體、表達(dá)空載體、干擾載體、干擾空載體四種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到豬睪丸ST細(xì)胞中,沒有處理過的細(xì)胞作為陰性對照組。轉(zhuǎn)染24小時后,接種1MOI PRRSV,24小時后各組分別搜集細(xì)胞上清液,提取病毒RNA,進(jìn)行絕對熒光定量PCR檢測病毒RNA水平的變化,并且提取病毒總蛋白,Western Blot檢測病毒M蛋白的表達(dá)水平。流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙染方法檢測ST細(xì)胞的細(xì)胞凋亡水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):與陰性對照組相比,IFI30基因的表達(dá)空載組和干擾空載組的PRRSV病毒的拷貝數(shù)和PRRSV的M蛋白表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)生顯著變化,ST細(xì)胞的凋亡水平也沒有顯著變化。而轉(zhuǎn)染p EF1a-IRES-Ds Red-IFI30表達(dá)載體,使得ST細(xì)胞中IFI30基因表達(dá)明顯升高時,PRRSV的病毒拷貝數(shù)和M蛋白量降低,證明PRRSV的復(fù)制受到IFI30的抑制。流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)IFI30過表達(dá)的ST細(xì)胞的凋亡率(9.73%)低于表達(dá)空載組(10.38%)。當(dāng)抑制IFI30基因的表達(dá)時,PRRSV的病毒拷貝數(shù)明顯上升,ST細(xì)胞的凋亡率(25.48%)也顯著高于干擾空載組(11.46%)。結(jié)論:豬IFI30在體外培養(yǎng)的Marc145細(xì)胞和ST細(xì)胞中抑制接種的PRRSV增殖,并降低了因接種PRRSV而引起的細(xì)胞凋亡。
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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.28

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳婧瑤;劉小娟;王宇航;李笠;胡曉湘;李寧;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒致病機(jī)理及其抗病育種研究進(jìn)展[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報;2013年11期

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本文編號：2370534