【摘要】：抗病育種能夠提高豬的抗病力,對養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展有著非常重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)豬對豬呼吸與繁殖綜合征病毒(PRRSV)的抗病力在不同豬種及不同個體間差異顯著。豬干擾素γ誘導蛋白30(IFI30),能夠在專職抗原遞呈細胞中組成性表達,在其他細胞中可被IFN-γ等一些炎癥因子誘導表達或表達量上調(diào)。其主要功能是催化蛋白質(zhì)二硫鍵的還原。其在Ⅱ類MHC限制性抗原加工遞呈過程中起關鍵性作用。有研究表明IFI30的表達情況對機體抗病毒免疫、腫瘤免疫以及應答狀態(tài)有影響。前期實驗研究發(fā)現(xiàn)當豬感染不同劑量的PRRSV時,豬肺巨噬細胞(PAMs)中IFI30的表達量發(fā)生變化,本研究的主要目的是探討豬IFI30對PRRSV在體外細胞中的增殖以及對感染宿主細胞的影響。本研究首先從采取的豬肺臟組織中擴增出IFI30中長度741bp的CDS區(qū),將其克隆到帶有紅色熒光的真核表達p EF1a-IRES-Ds Red-Express2上,構建出p EF1a-IRES-Ds Red-IFI30表達載體并將其轉(zhuǎn)染到對PRRSV敏感的Marc145細胞和豬睪丸細胞(ST細胞)中,通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染率以及q RT-PCR和Western Blot驗證構建的表達載體,實驗結果顯示:在Marc145細胞和ST細胞中IFI30載體的轉(zhuǎn)染率達到80%以上,轉(zhuǎn)染表達載體后的IFI30的m RNA水平和蛋白表達量都顯著高于對照組(P0.01)。其次,將p EF1a-IRES-Ds Red-IFI30表達載體以及空載體轉(zhuǎn)染進Marc145細胞中,24小時后轉(zhuǎn)染率達到80%~90%,然后接種1MOI的PRRSV,24小時后搜集細胞上清液,提取病毒RNA,進行絕對熒光定量PCR檢測病毒RNA水平的變化,并且提取病毒總蛋白,Western Blot檢測病毒M蛋白的表達水平。用流式細胞術Annexin V-FITC/PI雙染方法檢測Marc145細胞的凋亡率。實驗結果發(fā)現(xiàn):豬IFI30在Marc145細胞中表達時,PRRSV在宿主細胞中的拷貝數(shù)顯著低于空載組和對照組(p0.01),PRRSV的M蛋白的表達水平也顯著低于空載組和對照組(p0.01)。流式細胞術檢測豬IFI30表達組的細胞凋亡率(20.60%)顯著低于轉(zhuǎn)染空載組(66.0%)和對照組(64.66%)的凋亡率(p0.01)。最后,我們將豬IFI30的表達載體、表達空載體、干擾載體、干擾空載體四種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到豬睪丸ST細胞中,沒有處理過的細胞作為陰性對照組。轉(zhuǎn)染24小時后,接種1MOI PRRSV,24小時后各組分別搜集細胞上清液,提取病毒RNA,進行絕對熒光定量PCR檢測病毒RNA水平的變化,并且提取病毒總蛋白,Western Blot檢測病毒M蛋白的表達水平。流式細胞術Annexin V-FITC/PI雙染方法檢測ST細胞的細胞凋亡水平。實驗結果發(fā)現(xiàn):與陰性對照組相比,IFI30基因的表達空載組和干擾空載組的PRRSV病毒的拷貝數(shù)和PRRSV的M蛋白表達水平?jīng)]有發(fā)生顯著變化,ST細胞的凋亡水平也沒有顯著變化。而轉(zhuǎn)染p EF1a-IRES-Ds Red-IFI30表達載體,使得ST細胞中IFI30基因表達明顯升高時,PRRSV的病毒拷貝數(shù)和M蛋白量降低,證明PRRSV的復制受到IFI30的抑制。流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)IFI30過表達的ST細胞的凋亡率(9.73%)低于表達空載組(10.38%)。當抑制IFI30基因的表達時,PRRSV的病毒拷貝數(shù)明顯上升,ST細胞的凋亡率(25.48%)也顯著高于干擾空載組(11.46%)。結論:豬IFI30在體外培養(yǎng)的Marc145細胞和ST細胞中抑制接種的PRRSV增殖,并降低了因接種PRRSV而引起的細胞凋亡。
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【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.28

【參考文獻】

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1 陳婧瑤;劉小娟;王宇航;李笠;胡曉湘;李寧;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒致病機理及其抗病育種研究進展[J];畜牧獸醫(yī)學報;2013年11期

2 郭寶清,陳章水,劉文興,崔益洙;從疑似PRRS流產(chǎn)胎兒分離PRRSV的研究[J];中國畜禽傳染病;1996年02期

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本文編號：2370534