【摘要】：先天性抗病毒因子在機(jī)體抗病毒感染的免疫應(yīng)答過程中起著重要作用,是當(dāng)前抗病毒免疫研究的熱點(diǎn)問題。研究表明,鋅指蛋白也是一種先天性抗病毒因子,在機(jī)體的免疫系統(tǒng)扮演著重要角色。鋅指蛋白可以調(diào)節(jié)細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素、干擾素的表達(dá),并直接調(diào)控淋巴細(xì)胞的生長和分化。在先天免疫應(yīng)答過程中,鋅指蛋白直接或間接發(fā)揮抗病毒作用。盡管如此,在禽類上鋅指蛋白的研究幾乎是一片空白,對其結(jié)構(gòu)和功能一無所知。如果能通過研究禽鋅指蛋白的功能,篩選到一些在抗感染免疫中發(fā)揮重要功能的鋅指蛋白,將可能為新藥的開發(fā)或禽類疫病的防控提供新的思路,因此我們開展了以下幾方面內(nèi)容的研究。1)新城疫病毒感染對多種雞源鋅指蛋白表達(dá)的影響在前期研究中,本實(shí)驗(yàn)室通過高通量測序獲得了 NDV感染CEF細(xì)胞后鋅指蛋白的表達(dá)譜。在此基礎(chǔ)上,本研究篩選了 10種在病毒感染后表達(dá)量發(fā)生明顯變化的鋅指蛋白進(jìn)行后續(xù)研究。依據(jù)GenBank預(yù)測的鋅指蛋白基因序列,首先初步設(shè)計了檢測鋅指蛋白mRNA水平的RT-qPCR引物,對NDV感染DF-1細(xì)胞中10種鋅指蛋白表達(dá)量的變化情況進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示,chZC3HAV1、chZC3H6和chZEB1三種鋅指蛋白在病毒感染后表達(dá)下調(diào),在后期又明顯的上調(diào),說明這三種鋅指蛋白可能參與了病毒感染過程。隨后,我們從CEF細(xì)胞的cDNA樣品中擴(kuò)增出上述三種鋅指蛋白的完整基因序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。雞的chZC3HAV1、chZC3H6與其他禽類的同源基因親源性較近,其次是爬行動物,而與哺乳動物親源性最低,而雞的chZEB1蛋白在進(jìn)化上與其他禽類哺乳動物、爬行動物的親源性都很高,這說明ZEB1在進(jìn)化上非常保守。結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示雞源ZC3HAV1、ZC3H6和ZEB1蛋白具有和人源蛋白類似的功能結(jié)構(gòu)域,其鋅指結(jié)構(gòu)在進(jìn)化上是相對保守的,推測雞源和人源鋅指蛋白具有相似的功能。2)雞鋅指蛋白chZC3HAV1、chZC3H6和chZEB1的抗病毒功能的初步鑒定為了確認(rèn)chZC3HAV1、chZC3H6和chZEB1是否參與病毒感染后宿主細(xì)胞的抗感染免疫應(yīng)答過程,本研究對上述三種鋅指蛋白的抗病毒功能進(jìn)行了初步鑒定。首先,通過已經(jīng)獲得的chZC3HAV1、chZC3H6和chZEB1基因序列對qPCR檢測引物和體系進(jìn)行優(yōu)化,最終獲得了靈敏性高、特異性好、分別針對三種鋅指蛋白的RT-qPCR檢測方法。在對多種細(xì)胞和雞組織臟器中的鋅指蛋白進(jìn)行定量檢測,發(fā)現(xiàn)三種鋅指蛋白廣泛表達(dá)于雞的組織細(xì)胞中,脾臟和法氏囊中的表達(dá)量都相對較高。病毒感染試驗(yàn)結(jié)果顯示,在NDV感染中后期,chZC3HAV1、chZEB1表達(dá)量大幅上升;AIV感染能強(qiáng)有力刺激chZC3HAV1的上調(diào)表達(dá)。過表達(dá)chZEB1實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,chZEB1不能抑制NDV的增殖,說明chZEB1可能并不直接參與抗感染的免疫應(yīng)答,有可能是參與特異性免疫應(yīng)答過程中。過表達(dá)chZC3HAV1發(fā)現(xiàn),chZC3HAV1對NDV的增殖抑制能力不強(qiáng),卻能夠有限抑制AIV的增殖。3)chZC3HAV1抑制病毒增殖的機(jī)制研究本研究對chZC3HAV1抗病毒功能做了更進(jìn)一步的研究。首先,通過過表達(dá)chZC3HAV1,我們發(fā)現(xiàn)chZC3HAV1具有很強(qiáng)的抗ATV作用而對NDV抗病毒能力較弱。通過比較AIV和NDV感染后細(xì)胞不同時間點(diǎn)中chZC3HAV1的表達(dá),我們發(fā)現(xiàn)NDV不能在感染早期誘導(dǎo)chZC3HAV1的基因上調(diào),而整個AIV感染過程中,chZC3HAV1表達(dá)量一直上調(diào)。后續(xù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一現(xiàn)象,NDV感染早期,雞組織臟器中的chZC3HAV1表達(dá)量并未出現(xiàn)明顯上調(diào)。由于chZC3HAV1是一種早期抗病毒因子,推測NDV感染后chZC3HAV1表達(dá)的滯后是其不能有效發(fā)揮抗NDV作用的因素之一。本研究進(jìn)一步研究了 chZC3HAV1的抗病毒機(jī)制。通過雙熒光素酶檢測系統(tǒng),我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)chZC3HAV1不能激活NF-κB、IRF-3/7、IFN-β等信號通路,間接證明chZC3HAV1并不能和人源ZC3HAV1基因一樣,通過與RIG-Ⅰ的相互作用增強(qiáng)干擾素信號,這表明雞天然缺失RIG-Ⅰ造成了部分先天性免疫因子功能的缺陷。在chZC3HAV1過表達(dá)細(xì)胞中和上清中,病毒RNA的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對照組,暗示chZC3HAV1可能是直接識別病毒RNA并招募免疫因子降解病毒RNA發(fā)揮抗病毒作用的,這一推論有待于后續(xù)實(shí)驗(yàn)證明。
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【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2344403