【摘要】：雞毒支原體(Mycoplasma gallisepticum, MG),又稱雞毒霉形體或雞敗血支原體,是引起雞慢性呼吸道病的病原菌,也是現(xiàn)代養(yǎng)雞業(yè)最常見(jiàn)的病原之一,給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前控制MG感染的主要措施是病原凈化與疫苗接種。常用的疫苗主要有滅活疫苗和弱毒疫苗兩種,滅活疫苗生產(chǎn)成本高,且不能阻止MG垂直傳播；弱毒疫苗免疫力弱,存在毒力返強(qiáng)及感染非目標(biāo)雞群的風(fēng)險(xiǎn),從而制約了這兩種疫苗的使用,因此,亟需研發(fā)更安全高效的MG疫苗。而MG疫苗抗原的篩選是疫苗研發(fā)的關(guān)鍵和出發(fā)點(diǎn),本研究基于機(jī)體局部特異性抗體在抗MG感染過(guò)程中尤為重要的事實(shí),利用MG-HS感染雞群呼吸道沖洗液中特異性抗體篩選相應(yīng)的MG保護(hù)性抗原,并對(duì)候選抗原基因及其重組蛋白進(jìn)行了研究。本研究采用雞毒支原體感染健康雛雞,2w后采集血清和呼吸道沖洗液,分別用三種血清學(xué)方法進(jìn)行抗體檢測(cè)。其中,間接ELISA法用以區(qū)分黏膜抗體IgA和血清抗體IgY；血凝抑制試驗(yàn)和代謝抑制試驗(yàn)用以區(qū)分所產(chǎn)生的特異性抗體是否對(duì)雞毒支原體的生長(zhǎng)繁殖具有抑制作用,再以具有生長(zhǎng)抑制作用的感染性抗體,定向篩選雞毒支原體菌體表面的保護(hù)性抗原,取得了如下結(jié)果：1.感染雞呼吸道沖洗液中的IgY, IgA同為黏膜免疫抗體雞毒支原體通過(guò)滴鼻途徑感染后,呼吸道沖洗液中產(chǎn)生了高效價(jià)的IgA抗體(OD450為1.11±0.06),血清中則較低(OD450為0.46±0.09)；IgY抗體在感染雞的血清和氣管沖洗液中均具有很高的抗體效價(jià)(OD450分別為2.47±0.17和0.72±0.08),說(shuō)明雞毒支原體感染后,刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生了高效價(jià)的特異性血清抗體IgY,IgY不僅存在于血清中,而且也被分泌于黏膜表面,這種被分泌于黏膜面的IgY可能與IgA一起在黏膜免疫中共同發(fā)揮著抗感染作用。2.感染雞血清中的血凝抑制抗體(IgY)無(wú)代謝抑制作用將感染組和對(duì)照組的血清和呼吸道沖洗液進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn),檢測(cè)其血凝抑制抗體,結(jié)果表明感染組中血清的平均血凝抑制價(jià)為1：64,呼吸道沖洗液平均血凝抑制價(jià)為1：2,對(duì)照組血清和呼吸道沖洗液均沒(méi)有血凝抑制作用。代謝抑制試驗(yàn)結(jié)果表明,感染雞呼吸道沖洗液的代謝抑制效價(jià)為6.63±0.95 (log2, n=8),遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于血清的代謝抑制效價(jià)1.75±0.71 (log2, n=8)(P0.01)。3.感染雞產(chǎn)生的黏膜抗體IgA對(duì)雞毒支原體的生長(zhǎng)和代謝有抑制作用對(duì)感染雞血清、氣管沖洗液用三種血清學(xué)方法進(jìn)行了抗體檢測(cè),結(jié)果可以看出,感染2w后,血凝抑制抗體大量出現(xiàn)于血清中,而氣管沖洗液幾乎檢測(cè)不到；代謝抑制抗體僅在氣管沖洗液中檢出,血清中檢測(cè)結(jié)果為陰性,這與黏膜抗體IgA大量存在于氣管沖洗液、血清中較低的結(jié)果基本一致；IgY抗體則在血清和沖洗液中均能檢出。這些結(jié)果表明：(1)感染后產(chǎn)生的血清抗體IgY亦可作為黏膜抗體與IgA一起出現(xiàn)于黏膜表面；(2)血清中的高效價(jià)的血凝抑制抗體(血凝素抗體)對(duì)雞毒支原體的生長(zhǎng)代謝無(wú)抑制作用；(3)感染雞產(chǎn)生的黏膜抗體IgA對(duì)雞毒支原體的生長(zhǎng)和代謝有抑制作用,即特異性IgA所對(duì)應(yīng)的抗原可能就是雞毒支原體的保護(hù)性抗原。4.三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)可能是雞毒支原體的保護(hù)性抗原以雞毒支原體全菌體為抗原,感染雞的呼吸道沖洗液為一抗,羊抗雞IgA及IgY分別為二抗進(jìn)行Western-blot分析,回收主要顯色條帶進(jìn)行質(zhì)譜分析和生物信息學(xué)相關(guān)分析。結(jié)果表明,感染雞氣管沖洗液中MG特異性抗體相對(duì)應(yīng)的抗原成分有2個(gè),一個(gè)為3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-p dehydrogenase, GAPDH),大小為37KD,是一種糖代謝相關(guān)酶；另一個(gè)為VlhA4.12蛋白,大小為75KD,為血凝素家族中的成員。根據(jù)三種血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果(表4-3)綜合分析,被篩選到的分子量大小為37KD的三磷酸甘油醛脫氫酶可能就是雞毒支原體的一種保護(hù)性抗原；而VlhA4.12蛋白可能與我們以前報(bào)道的pMGA相關(guān)。5.三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)及VlhA4.12蛋白的表達(dá)研究利用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)獲得候選抗原基因,并對(duì)其中編碼色氨酸的TGA進(jìn)行突變后進(jìn)行原核表達(dá),并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物活性進(jìn)行鑒定。結(jié)果成功突變GAPDH和VlhA4.12基因中色氨酸編碼子TGA,并進(jìn)行了原核表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物均能與MG感染雞的呼吸道沖洗液發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)。但重組蛋白(GAPDH (rGAPDH)免疫小鼠制備的免疫血清對(duì)MG沒(méi)有生長(zhǎng)/代謝抑制作用。上述結(jié)果為進(jìn)一步進(jìn)行MG黏膜免疫機(jī)制研究拓展了新的思路,為MG免疫預(yù)防及亞單位疫苗的研發(fā)提供了新的靶標(biāo)。
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【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.62

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳鳳梅,牛鐘相,程光民,王勇;雞毒支原體研究進(jìn)展[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2004年03期

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本文編號(hào)：2342878