【摘要】：豬瘟是由豬瘟病毒(CSFV)引起豬的一種急性或慢性、熱性和高度接觸性傳染病。豬瘟病毒NS5B蛋白是非結(jié)構(gòu)蛋白,具有RNA依賴的RNA多聚酶活性,能與3'端非翻譯區(qū)結(jié)合,負(fù)責(zé)病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。因此,制備豬瘟病毒NS5B蛋白多克隆抗體對(duì)進(jìn)一步研究豬瘟病毒NS5B蛋白與宿主免疫應(yīng)答因子的相互作用具有重要意義。豬瘟病毒在感染宿主過程中會(huì)抑制Ⅰ型干擾素(IFN-Ⅰ)的產(chǎn)生,逃逸宿主的免疫應(yīng)答,導(dǎo)致持續(xù)性感染。IFN-Ⅰ的產(chǎn)生受Toll樣受體(TLR)信號(hào)通路和視黃酸誘導(dǎo)基因Ⅰ受體(RLR)信號(hào)通路調(diào)控。在TLR信號(hào)通路中,主要通過接頭分子p干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TRIF)和髓樣分化因子(MyD88)接收上游受體分子信號(hào),將其傳遞給下游相關(guān)分子從而引起一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)。在RLR信號(hào)通路中,通過接頭分子線粒體抗病毒信號(hào)蛋白(MAVS)激活下游分子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。目前生物制品市場(chǎng)上尚無這些抗體商品,沒有這些抗體就難以對(duì)豬瘟病毒與宿主的相互作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。因此,制備TRIF、MyD88和MAVS的多克隆抗體將為進(jìn)一步研究豬瘟病毒感染后宿主TLR和RLR信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制或豬瘟病毒的免疫逃避機(jī)制打下良好基礎(chǔ)。本研究通過RT-PCR擴(kuò)增并克隆了CSFV NS5B基因片段、豬TRIF、 MyD88和MAVS基因ORF的部分序列,構(gòu)建了CSFV NS5B基因片段及TRIF、MyD88和MAVS基因的原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化表達(dá)菌Rosetta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞,利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白,采用Ni-NTA親和層析等方法進(jìn)行純化,純化的蛋白免疫昆明小鼠制備多克隆抗體,通過蛋白免疫印跡(Western Blot)和間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)驗(yàn)證所制備多克隆抗體的反應(yīng)性和特異性。本研究制備的多克隆抗體不僅與原核表達(dá)的重組蛋白發(fā)生反應(yīng),也與感染了CSFV的PK-15細(xì)胞表達(dá)的蛋白具有較高的特異性。用Western Blot檢測(cè)抗CSFV NS5B多克隆抗體與原核表達(dá)的NS5B重組蛋白反應(yīng)的稀釋度可達(dá)1：8000,其他三個(gè)抗體與相應(yīng)原核表達(dá)的重組蛋白反應(yīng)稀釋度可達(dá)1：16000。用構(gòu)建的pcDNA3.0-NS5BFL真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞,通過Western Blot和IFA均檢測(cè)到了瞬時(shí)表達(dá)的NS5B蛋白,IFA檢測(cè)的最佳工作濃度為1：200。CSFV感染PK-15細(xì)胞后Western Blot檢測(cè)多抗的特異性,抗CSFV NS5B、TRIF、MyD88和MAVS多克隆抗體的最佳工作濃度分別為1：2000、1：1000、1：500和1：1000。本研究通過實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)(qPCR)和Western Blot技術(shù)對(duì)感染1.0MOI CSFV后PK-15細(xì)胞中免疫應(yīng)答因子TRIF、MyD88和MAVS的mRNA和蛋白水平進(jìn)行了檢測(cè)。綜合上述實(shí)驗(yàn),本研究發(fā)現(xiàn)TRIF mRNA在感染豬瘟病毒后上調(diào)不顯著,其蛋白水平也未呈現(xiàn)明顯上調(diào)趨勢(shì)；MAVS和MyD88mRNA分別在感染豬瘟病毒12和24 h后顯著上調(diào),其蛋白變化水平與mRNA水平一致。由此推測(cè)豬瘟病毒感染PK-15細(xì)胞后激活TLR信號(hào)通路和RLR信號(hào)通路,其中,激活的TLR信號(hào)通路主要為MyD88依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
[Abstract]:Swine fever is an acute or chronic, feverish and highly contagious disease caused by swine fever virus (CSFV). The NS5B protein of classical swine fever virus (CSFV) is a non-structural protein with the activity of RNA dependent RNA polymerase and can bind to 3 '-terminal untranslated region, which is responsible for the transcription and replication of the virus genome. Therefore, the preparation of polyclonal antibodies against CSFV NS5B protein is of great significance to further study the interaction between CSFV NS5B protein and host immune response factors. Swine fever virus (CSFV) inhibits the production of interferon type I (IFN- 鈪，

本文編號(hào)：2331230