【摘要】：鵝球蟲(chóng)是一類(lèi)寄生于家鵝及雁形目(Anseriformes)鳥(niǎo)類(lèi)的消化道或腎臟細(xì)胞的寄生性原蟲(chóng),在分類(lèi)上隸屬?gòu)?fù)頂亞門(mén)(Apicocomplexa)、孢子蟲(chóng)綱(Sporozoa)、真球蟲(chóng)目(Eumeriina)、艾美耳科(Eimeriidae),呈世界性分布。鵝球蟲(chóng)種類(lèi)眾多,臨床上多為混合感染,傳統(tǒng)分類(lèi)方法鑒別難度較大。本研究采用單卵囊分離方法建立了鵝艾美耳球蟲(chóng)(Eimeria anseris)、赫爾曼艾美耳球蟲(chóng)(E. hermani)、多斑艾美耳球蟲(chóng)(E. stigmosa)和金黃艾美耳球蟲(chóng)(E.fulva)等4種鵝球蟲(chóng)純種株,對(duì)其18S rDNA及ITS rDNA序列進(jìn)行了克隆與序列分析,并分析了鵝球蟲(chóng)與其他動(dòng)物球蟲(chóng)間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,旨在分子水平對(duì)鵝球蟲(chóng)作進(jìn)一步鑒別分析,為鵝球蟲(chóng)的分子鑒別診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查奠定基礎(chǔ)。1、揚(yáng)州地區(qū)鵝球蟲(chóng)的流行病學(xué)調(diào)查采用形態(tài)學(xué)分類(lèi)方法,對(duì)揚(yáng)州的高郵、江都、邗江、儀征、寶應(yīng)等不同地區(qū)的63個(gè)鵝群進(jìn)行鵝球蟲(chóng)檢查,感染球蟲(chóng)的鵝群為57個(gè),感染率為90.47%；3周齡以內(nèi)鵝群的球蟲(chóng)感染率最低,感染率為66.66%,3-9周齡球蟲(chóng)感染率最高,感染率為100%。不同地區(qū)鵝群均檢測(cè)到有較高的球蟲(chóng)感染率,其中邗江、儀征、寶應(yīng)3地的鵝群球蟲(chóng)感染率均高達(dá)100.00%。鵝球蟲(chóng)多為混合感染,混合感染率為85.96%。共檢到1科2屬6種球蟲(chóng),其中艾美耳屬(Eimeria) 5種：鵝艾美耳球蟲(chóng)(E. anseris)、赫爾曼艾美耳球蟲(chóng)(E. hermani)、金黃艾美耳球蟲(chóng)(E.fulva)、有毒艾美耳球蟲(chóng)(E. nocens)、多斑艾美耳球蟲(chóng)(E. stigmosa);泰澤屬(Tyzzeria)1種：稍小泰澤球蟲(chóng)(T. parvula);其中稍小泰澤球蟲(chóng)和赫爾曼艾美耳球蟲(chóng)為優(yōu)勢(shì)種,其感染率分別為74.60%和65.08%。2、四種鵝球蟲(chóng)的分離鑒別與純種株的建立采用單卵囊分離技術(shù),獲得了4株純種鵝球蟲(chóng),并鑒定為鵝艾美耳球蟲(chóng)、赫爾曼艾美耳球蟲(chóng)、多斑艾美耳球蟲(chóng)與金黃艾美耳球蟲(chóng)。主要鑒定指標(biāo)如下：鵝艾美耳球蟲(chóng)：潛在期6d左右,幼鵝臨床癥狀明顯,部分幼鵝死亡。卵囊呈梨形,前端異常狹窄,卵囊壁為單層結(jié)構(gòu),無(wú)色,厚度約1μm,囊壁光滑,有卵膜孔,無(wú)極帽,孢子囊為卵圓形,有孢子囊殘?bào)w,卵囊大小為(18.5-22.7) μm×(14.1-19.3)μm。赫爾曼艾美耳球蟲(chóng)：潛在期4 d左右,幼鵝臨床癥狀不明顯。卵囊呈卵圓形,卵囊壁為雙層結(jié)構(gòu),無(wú)色,較厚,囊壁光滑,有卵膜孔,無(wú)極帽,孢子囊為卵圓形,斯氏體不明顯,卵囊大小為(24.0～27.6)μum×(17.5～19.5)多斑艾美耳球蟲(chóng)：潛在期4.5 d左右,幼鵝臨床癥狀不明顯。卵囊呈寬卵圓形,黃褐色,卵囊壁厚度為1.2-2.0μm,兩端比側(cè)面厚,囊壁表面有斑點(diǎn),有卵膜孔,無(wú)極帽,孢子囊為卵圓形,孢子囊殘?bào)w為細(xì)小的顆粒,卵囊大小為(19.7～23.3)μm×(14.1～19.3)μmo金黃艾美耳球蟲(chóng)：潛在期7d左右,幼鵝臨床癥狀較明顯,無(wú)幼鵝死亡。卵囊呈寬卵圓形,黃褐色,卵囊壁為雙層,外層有交叉的條紋,孢子化卵囊的窄端有一個(gè)大的折光顆粒,孢子囊有斯氏體,每個(gè)孢子囊含有粗大顆粒狀的殘?bào)w,有卵膜孔,無(wú)極帽,孢子囊殘?bào)w為細(xì)小的顆粒,卵囊大小為(25.6～32.4)μm×(20.2～25.2)3、四種鵝球蟲(chóng)188區(qū)序列的克隆與序列分析在分析了多種艾美耳球蟲(chóng)18SrDNA序列的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)一對(duì)艾美耳屬球蟲(chóng)的通用引物,分別對(duì)鵝艾美耳球蟲(chóng)、赫爾曼艾美耳球蟲(chóng)、多斑艾美耳球蟲(chóng)、金黃艾美耳球蟲(chóng)18S rDNA部分序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆和測(cè)序,并用DNAstar軟件對(duì)這4種鵝球蟲(chóng)與15種艾美耳球蟲(chóng)的18S rDNA序列進(jìn)行同源性分析,最后以火雞組織滴蟲(chóng)為外類(lèi)群,采用鄰接法構(gòu)建了4種鵝球蟲(chóng)與29種艾美耳亞目原蟲(chóng)的18S rDNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果顯示,鵝艾美耳球蟲(chóng)、赫爾曼艾美耳球蟲(chóng)、多斑艾美耳球蟲(chóng)和金黃艾美耳球蟲(chóng)的18S rDNA部分序列長(zhǎng)度分別為1695 bp、1696 bp、1703 bp、1694 bp蟲(chóng)種間的相似性以4種鵝球蟲(chóng)最高,其次為鵝球蟲(chóng)與鶴源艾美耳球蟲(chóng)。在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中,艾美耳屬球蟲(chóng)與成囊類(lèi)球蟲(chóng)各形成一個(gè)單系分支；錦鯉的艾美耳球蟲(chóng)與其他動(dòng)物的艾美耳球蟲(chóng)形成姊妹群關(guān)系；濕地鳥(niǎo)類(lèi)的艾美耳球蟲(chóng)聚合為一分支,雞形目和哺乳類(lèi)動(dòng)物的艾美耳球蟲(chóng)形成另一分支。本研究為利用18SrDNA序列來(lái)鑒定鵝球蟲(chóng)種類(lèi)奠定了理論基礎(chǔ)。4、四種鵝球蟲(chóng)ITS區(qū)序列的克隆與序列分析用一對(duì)艾美耳屬球蟲(chóng)ITS rDNA序列的通用引物,分別對(duì)鵝艾美耳球蟲(chóng)、赫爾曼艾美耳球蟲(chóng)、多斑艾美耳球蟲(chóng)、金黃艾美耳球蟲(chóng)ITS rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆和測(cè)序,并用DNAstar軟件對(duì)這4種鵝球蟲(chóng)的ITS rDNA序列進(jìn)行同源性分析,最后以火雞組織滴蟲(chóng)為外類(lèi)群,采用最大簡(jiǎn)約法分別構(gòu)建4種鵝球蟲(chóng)的ITS全序列進(jìn)化樹(shù)以及與其它多種不同艾美耳亞目原蟲(chóng)的ITS全序列、ITS-1序列、ITS-2序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果顯示,鵝艾美耳球蟲(chóng)、赫爾曼艾美耳球蟲(chóng)、多斑艾美耳球蟲(chóng)和金黃艾美耳球蟲(chóng)的ITS rDNA序列長(zhǎng)度分別為1051 bp、1000 bp、926bp、1073bp。4種鵝球蟲(chóng)5.8S序列相似性最高,ITS-1序列相似性最低,ITS全序列及ITS-2序列相似性相近。從4種鵝球蟲(chóng)的ITS全序列進(jìn)化樹(shù)來(lái)看,形態(tài)學(xué)具有一定相似性的鵝球蟲(chóng)同樣表現(xiàn)出在進(jìn)化關(guān)系上的親近性,而其它三個(gè)進(jìn)化樹(shù)并不能很好的描述不同動(dòng)物源球蟲(chóng)之間的進(jìn)化關(guān)系。本研究顯示ITS rDNA序列適用于鵝球蟲(chóng)的分類(lèi)鑒定及種下進(jìn)化分析。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S852.7

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本文編號(hào)：2330451