【摘要】：H9N2亞型流感病毒(IAV)最早于1966年在北美的火雞中被檢測到,隨后在世界范圍內廣泛流行,給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經濟損失。H9N2亞型流感病毒經過20多年在多種動物中的傳播,其HA基因發(fā)生了較多的突變,其中包括糖基化位點數(shù)量的變化或者位置的轉移。本論文通過對近20年60株H9N2亞型流感病毒HA蛋白的潛在糖基化位點的分析,發(fā)現(xiàn)隨著時間的推移(1994-2014年),部分H9N2亞型病毒的HA蛋白218位從先前的潛在糖基化位點變異為非糖基化位點,而313位從先前的非糖基化位點變?yōu)闈撛谔腔稽c,并且在218位潛在糖基化位點發(fā)生缺失的病毒中,其313位全部變成了潛在糖基化位點。本實驗擬探究H9N2亞型流感病毒在HA蛋白的218和313位糖基化位點的變化對H9N2亞型流感病毒生物學特性的影響。1.H9N2亞型流感病毒HA蛋白313/218位糖基化位點變異的構建及病毒拯救本論文以1998年分離的Ck/SH/F/98(H9N2)(以下簡稱為F/98株)流感病毒為骨架,以F/98株的HA為模板,通過分子克隆技術,構建獲得在F/98株HA基因的313位增加一個糖基化位點的轉錄/表達質粒pHW204-HA/313G+,和在HA基因的313位增加一個糖基化位點時,在218位同時減少一個糖基化位點的轉錄/表達質粒pHW204-HA/218G-313G+;將轉錄/表達質粒pHW204-HA/313G+、pHW204-HA/218G-313G+,分別與F/98株的其余7個基因的轉錄/表達質粒pH W201-PB2、pH W202-PB1、pH W203-PA、pH W205-NP、pH W206-NA、pHW207-M、pHW208-NS組成八質粒系統(tǒng),經反向遺傳學技術拯救病毒,拯救出在F/98株的HA蛋白313位增加一個糖基化位點的病毒rF/HA313G+,和在HA蛋白218位減少一個糖基化位點并在313位增加一個糖基化位點的病毒rF/HA218G-/313G+。將rF/HA313G+和rF/HA218G-/313G+病毒經Western-blot鑒定發(fā)現(xiàn),與F/98株病毒的HA蛋白的遷移率比較,病毒rF/HA313G+HA蛋白的遷移速率明顯降低;而病毒rF/HA218G-/313G +HA蛋白的遷移速率位于F/98株與rF/HA313G+株之間,表明218位和313位的潛在糖基化都是功能性糖基化位點。2.HA蛋白313/218位糖基化位點變異對病毒生物學特性的影響為了研究HA蛋白糖基化位點變化對病毒生物學特性的影響,本實驗以母本病毒F/98株為對照、對rF/HA313G+和rF/HA218G-/313G+株病毒進行了雞胚半數(shù)感染量(EID50)、雞胚半數(shù)致死量(ELD50)、細胞半數(shù)感染量(TCID50)測定、對雞的致病性和傳播途徑特性以及交叉免疫保護特性的研究。將病毒的EID50和TCID50結果對比發(fā)現(xiàn):與母本病毒F/98株比較,rF/HA313G+病毒的雞胚和細胞感染能力分別增加了 6.76倍和7.07倍,而rF/HA218G-/313G+病毒的感染力沒有顯著差異;與rF/HA313G+病毒株比較,rF/HA218G-/313G+病毒的雞胚和細胞感染力分別降低了 5.62倍和6.02倍。感染病毒雞的氣管和肺組織中的EID50結果顯示,與母本病毒F/98株比較,在病毒攻毒后3d和5d,rF/HA313G+病毒在雞氣管中的復制滴度分別增加了 5.62倍、3.16倍,肺組織中的復制滴度都增加了 3.16倍;與rF/HA313G+病毒株比較,在攻毒后3d和5d,rF/HA218G-/313G+病毒在雞氣管中的復制滴度比rF/HA313G+病毒分別下降了 3.16倍、1.78倍,在肺組織中的復制滴度比rF/HA313G+病毒都下降了 3.16倍;rF/HA218G-/313G+病毒在氣管和肺組織中的復制滴度與F/98株相比沒有顯著差異。三株病毒的傳播特性實驗結果發(fā)現(xiàn)病毒F/98、rF/HA313G+和rF/HA218G-/313G+都可以通過直接接觸和氣溶膠傳播;病毒的交叉免疫保護實驗結果發(fā)現(xiàn),免疫F/98株疫苗的雞,經F/98、rF/HA313G+和rF/HA218G-/313G+的攻毒后,在氣管和泄殖腔都沒有分離到病毒,表明表明313、218位潛在糖基化位點的變化對病毒的氣溶膠傳播特性和抗原性沒有影響。以上結果表明H9N2流感病毒的HA蛋白中313/218位糖基化位點的變化影響了病毒對雞胚和雞的感染力和病毒在組織中的復制能力,但313/218位糖基化位點對病毒的氣溶膠傳播特性和抗原性沒有影響。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.65

【參考文獻】

相關期刊論文 前4條

1 盧建紅,劉秀梵,邵衛(wèi)星,張評滸,韋棟平;H9N2亞型禽流感病毒基因組全長序列測定和各基因的遺傳分析[J];微生物學報;2003年04期

2 程堅,劉紅旗,彭大新,張如寬,劉秀梵;兩株H_9亞型禽流感病毒HA基因序列分析[J];江蘇農業(yè)研究;2001年01期

3 陳福勇，，夏春;禽流感A/雞/北京/1/96(H9N2)株核蛋白基因克隆和序列分析[J];中國預防獸醫(yī)學報;1999年02期

4 陳伯倫,張澤紀,陳偉斌;雞A型禽流感病毒的分離與血清學初步鑒定[J];中國家禽;1997年11期

相關博士學位論文 前2條

1 平繼輝;H9N2亞型禽流感病毒抗原變異及感染哺乳動物分子機制的研究[D];南京農業(yè)大學;2008年

2 石火英;影響H9N2亞型AIV傳播途徑的分子機制和構建致弱的8基因全禽源H5N1亞型重排AIV[D];揚州大學;2005年

本文編號：2329146