發(fā)布時(shí)間：2018-11-10 20:14

【摘要】：白細(xì)胞介素22(IL-22),屬于IL-10家族成員,主要由T淋巴細(xì)胞和固有淋巴細(xì)胞分泌,在體內(nèi)通過(guò)與其受體(IL-22R1和IL-10R2)結(jié)合形成異源二聚體受體復(fù)合物并激活信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn),人和鼠的IL-22在體內(nèi)發(fā)揮抗炎和促炎的雙重作用:一方面,它主要作用于黏膜上皮細(xì)胞,在黏膜損傷的修護(hù),炎癥反應(yīng)及抗感染中發(fā)揮重要作用;另一方面,IL-22在組織中的長(zhǎng)期過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致宿主慢性炎癥的發(fā)生。小腸作為宿主免疫的重要場(chǎng)所,是IL-22發(fā)揮生物效應(yīng)的關(guān)鍵部位。近年來(lái)對(duì)IL-22的研究主要集中在人源和鼠源,魚IL-22也曾有報(bào)道,但豬IL-22的研究尚未見報(bào)道。鑒于此,本研究旨在通過(guò)以下二方面的研究闡釋豬IL-22能否發(fā)揮保護(hù)宿主抵御病原入侵、抵抗感染的作用,為豬IL-22的研究奠定基礎(chǔ)。(1)豬白細(xì)胞介素22的原核表達(dá)和活性研究從豬外周血單核細(xì)胞衍生的DC細(xì)胞中克隆出大小為568 bp的豬IL-22基因序列和去信號(hào)肽的IL-22成熟序列。首先將該去信號(hào)肽基因片段克隆到原核表達(dá)載體PET-30a(Amp+)中,構(gòu)建重組質(zhì)粒PET-30a/IL-22,再將陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)了大小為22 KD的重組蛋白His/IL-22,并利用Ni-NTA親和層析法進(jìn)行純化。生物學(xué)活性檢測(cè)結(jié)果顯示:純化的His/IL-22對(duì)豬IPEC-J2中IL-18、IFN-λ和BD-2均有上調(diào)表達(dá)的作用,當(dāng)用終濃度為0.04μg/m L的重組蛋白處理IPEC-J2細(xì)胞時(shí),隨著His/IL-22對(duì)IPEC-J2細(xì)胞處理時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞中這三種細(xì)胞因子表達(dá)呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì),在48 h時(shí),三種細(xì)胞因子的表達(dá)量均達(dá)到最大。此外,病毒增殖抑制試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)His/IL-22具有抑制PEDV-CV777和Po RV在IPEC-J2中復(fù)制的作用。這一結(jié)果首次證明豬IL-22能夠上調(diào)IPEC-J2中細(xì)胞因子的表達(dá),并且?guī)椭鶬PEC-J2抵抗病毒感染。(2)豬IL-22單克隆抗體的制備以前期試驗(yàn)獲得的具有生物活性的His/IL-22蛋白作為抗原,腹腔免疫6-8周齡雌性BALB/C小鼠,取其脾細(xì)胞,通過(guò)細(xì)胞融合的方法通篩選出了4株能分泌抗豬IL-22抗體的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞,分別命名為2G10、2C7、6B11、7F3,這四株細(xì)胞分泌的抗體亞型均為Ig M K型。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞培養(yǎng)上清抗體效價(jià)測(cè)定的結(jié)果選取了效價(jià)較高的6B11和7F3細(xì)胞株制備腹水,ELISA測(cè)定6B11細(xì)胞株培養(yǎng)上清及其腹水效價(jià),分別為1∶50和1∶25 600,7F3細(xì)胞株的培養(yǎng)上清及其腹水效價(jià)分別為1∶100和1∶6 400。本次試驗(yàn)制備的豬IL-22單克隆抗體為建立準(zhǔn)確快速檢測(cè)豬IL-22的ELISA方法奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Interleukin 22 (IL-22), a member of the IL-10 family, is secreted mainly by T lymphocytes and innate lymphocytes. In vivo biological functions are performed by binding to its receptors (IL-22R1 and IL-10R2) to form heterodimer receptor complexes and to activate signaling pathways. It has been found that IL-22 plays a dual role of anti-inflammatory and pro-inflammatory in vivo. On the one hand, it mainly acts on mucosal epithelial cells and plays an important role in the repair of mucosal injury, inflammatory response and anti-infection. On the other hand, long-term overexpression of IL-22 may lead to chronic inflammation of the host. Small intestine, as an important site of host immunity, is the key site of biological effect of IL-22. In recent years, the research on IL-22 is mainly focused on human and mouse sources, fish IL-22 has also been reported, but the study of porcine IL-22 has not been reported. In view of this, the purpose of this study is to elucidate whether porcine IL-22 can protect the host against pathogen invasion and infection through the following two aspects of research. (1) prokaryotic expression and activity of porcine interleukin-22; cloning of porcine IL-22 gene sequence and de-signal from porcine peripheral blood monocyte derived DC cells with the size of 568 bp IL-22 mature sequence of peptide. Firstly, the gene fragment was cloned into prokaryotic expression vector PET-30a (Amp), and the recombinant plasmid PET-30a/IL-22, was constructed. Then the positive recombinant plasmid was transformed into E. coli BL21 (DE3) to induce the expression of 22 KD recombinant protein His/IL-22, and purified by Ni-NTA affinity chromatography. The results of biological activity test showed that purified His/IL-22 could up-regulate the expression of IL-18,IFN- 位 and BD-2 in porcine IPEC-J2. When the recombinant protein with final concentration of 0.04 渭 g / mL was used to treat IPEC-J2 cells, With the prolongation of the treatment time of His/IL-22 on IPEC-J2 cells, the expression of these three cytokines increased gradually, and the expression of the three cytokines reached the maximum at 48 h. In addition, virus proliferation inhibition test found that His/IL-22 can inhibit the replication of PEDV-CV777 and Po RV in IPEC-J2. This result is the first to prove that porcine IL-22 can up-regulate the expression of cytokines in IPEC-J2. And to help IPEC-J2 resist virus infection. (2) the preparation of porcine IL-22 monoclonal antibody, using bioactive His/IL-22 protein obtained in previous tests as antigen, was intraperitoneally immunized with 6-8 week-old female BALB/C mice. Four positive hybridoma cells which secreted anti-porcine IL-22 antibody were selected by cell fusion method and named as 2G10C7C7B117F3. The antibody subtypes secreted by these four strains were all Ig M K type. Ascites were prepared from 6B11 and 7F3 cell lines with high titer, and supernatant and ascites titers of 6B11 cell lines were determined by ELISA according to the results of antibody titer test in cell culture supernatants. The supernatant and ascites titers of the cell lines at 1:50 and 1:25 were 1: 100 and 1:6 400, respectively. The monoclonal antibody to porcine IL-22 prepared in this study laid a foundation for the establishment of an accurate and rapid ELISA method for the detection of porcine IL-22.
【學(xué)位授予單位】：青海大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.4

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本文編號(hào)：2323501