【摘要】：單核細胞趨化蛋白1(Monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)是趨化因子CC亞家族的一員。MCP-1主要趨化單核細胞和T淋巴細胞,使各種炎性細胞尤其是單核細胞向病變部位聚集,從而在機體防御、慢性炎癥及抗腫瘤等方面起重要作用。血液中的單核細胞在特異的趨化因子作用下,發(fā)生遷移并聚集在不同病變組織中發(fā)揮重要的生物學效應,如吞噬和殺傷病原微生物,遞呈抗原及分泌多種生物活性物質等。本研究克隆表達了牛MCP-1基因并制備了牛MCP-1單克隆抗體,為MCP-1在治療炎癥疾病、免疫診斷研究中提供了重要的生物材料。1.牛MCP-1基因的克隆及表達用ConA刺激健康荷斯坦奶牛外周血淋巴細胞,并提取細胞總RNA,以RT-PCR方法反轉錄為cDNA,再以cDNA為模板成功擴增到所需不含信號肽(BoMCP-1)和含信號肽(BoPreMCP-1)目的基因,同時還擴增了 GFP-BoPreMCP-1基因。將BoMCP-1基因分別與表達載體pET-30a(+)和pGEX-6p-1相連接構建重組質粒,將BoPreMCP-1基因與載體pVAX1相連構建重組質粒,并進行雙酶切以及測序鑒定,鑒定結果通過DNA star軟件分析均正確,無任何突變。構建成功的重組質粒分別命名為pET-30a-BoMCP-1、pGEX-6p-1-BoMCP-1、pVAX1-BoPreMCP-1 和 pVAX1-GFP-BoPreMCP-1。將原核表達載體轉入宿主菌后,經0.5 mM/L IPTG誘導表達后進行SDS-PAGE分析,出現(xiàn)預期的目的條帶,條帶大小分別為17kDa和36 kDa左右。通過免疫親和層析法進行蛋白的純化,Western blot結果顯示純化蛋白具有良好的免疫反應性,說明重組蛋白rHis-BoMCP-1和rGST-BoMCP-1均成功獲得表達。2.牛MCP-1單克隆抗體的制備與初步應用將純化得到的重組蛋白rHis-BoMCP-1免疫6周齡BALB/c小鼠,經3次免疫后,運用淋巴細胞雜交瘤技術融合細胞,以純化重組蛋白rGST-BoMCP-1為檢測原,運用間接ELISA方法篩選陽性克隆,經過3次亞克隆后,共獲得3株能穩(wěn)定分泌特異性BoMCP-1單抗的雜交瘤細胞株,分別命名為3D10、4G9和6F5。亞型鑒定結果顯示3D10和4G9單抗為IgA亞型,6F5為IgG1亞型。間接ELISA測定效價結果顯示6F5單抗上清效價為3200,3D10和4G9上清效價均為12800;制備上述三株單抗腹水,間接ELISA測定其效價,除了 6F5的腹水效價較低為32000,3D10和4G9腹水效價分別為256000和512000。間接ELISA還顯示除6F5單抗與畢赤酵母表達的商品化牛MCP-1的反應性一般,3D10和4G9單抗與畢赤酵母表達的商品化牛MCP-1的反應性較好。Western blot結果顯示所獲得的3株單抗均與融合蛋白rHis-BoMCP-1和rGST-BoMCP-1發(fā)生反應。構建成功的pVAX1-GFP-BoPreMCP-1轉染293T細胞后,間接免疫熒光分析單抗與MCP-1蛋白的反應性,結果顯示3株單抗均與真核表達的GFP-BoPreMCP-1有很好的反應性。應用流式細胞術結合胞內染色技術分析單抗與天然牛MCP-1蛋白的反應性,首先對3株抗體進行流式細胞術方法的篩選優(yōu)化:①選擇兩種不同的細胞的刺激劑ConA和LPS;②設置不同的抗體濃度,從而得到比較穩(wěn)定的流式結果。結果顯示只有4G9與天然BoMCP-1有較好的反應性。將4G9抗體應用于牛結核病的診斷,建立基于特異性抗原的流式細胞檢測方法。采集經過TST和牛結核丫干擾素ELISA檢測試劑盒驗證的牛結核陽性和牛結核陰性的牛外周血,用特異性抗原ESAT-6/CFP-10重組蛋白刺激牛外周血單個核細胞后,使用4G9單抗進行流式細胞術檢測,結果表明基于單抗4G9的流式細胞術具有較好的應用潛能。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.4

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