【摘要】：為構(gòu)建表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的復(fù)制缺陷型西尼羅病毒(WNV),本研究參考NY99株WNV基因組序列,分段合成除結(jié)構(gòu)蛋白基因外的其它基因組序列,以及插入缺失的結(jié)構(gòu)蛋白基因位置的gfp報告基因序列,并按WNV基因組順序克隆于pCI-neo載體中,構(gòu)建含有GFP基因的WNV復(fù)制子重組質(zhì)粒pWNVrep-GFP;同時構(gòu)建表達(dá)WNVC蛋白的重組質(zhì)粒pCAG-WNV-C。將pWNVrep-GFP和pCAG-WNV-C共轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)WNVprM-E蛋白的W-92細(xì)胞系進(jìn)行WNV粒子包裝及病毒粒子拯救。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞能夠表達(dá)GFP,將轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)液接種BHK-21細(xì)胞后,能感染細(xì)胞并且表達(dá)GFP,westernblot可以檢測到分子質(zhì)量為42ku的NS1蛋白條帶。然而,感染BHK-21細(xì)胞的培養(yǎng)液不能再感染BHK-21細(xì)胞,表明拯救的病毒只具有一次感染能力,為復(fù)制缺陷型病毒。WNV陽性血清能中和拯救病毒對BHK-21細(xì)胞的感染,該復(fù)制缺陷型病毒為WNV中和抗體檢測和疫苗評價提供了相關(guān)的技術(shù)平臺。
[Abstract]:In order to construct the replication-deficient West Nile virus (WNV),) (WNV), expressing green fluorescent protein (GFP), the genomic sequence of WNV strain of NY99 strain was studied, and other genomic sequences except structural protein gene were synthesized. The gfp reporter gene sequence of the deleted structural protein gene was inserted and cloned into the pCI-neo vector according to the WNV genomic sequence. The WNV replicon recombinant plasmid pWNVrep-GFP; containing the GFP gene was constructed. Construction of Recombinant plasmid pCAG-WNV-C. expressing WNVC protein at the same time PWNVrep-GFP and pCAG-WNV-C were co-transfected into W-92 cell line, which expressed WNVprM-E protein stably. WNV particle packaging and virus particle rescue were carried out. The results showed that the transfected cells could express GFP, after inoculating the transfected cells with BHK-21 cells, and the expression of GFP,westernblot could detect the NS1 protein bands with molecular weight of 42ku. However, the culture medium infected with BHK-21 cells can no longer infect BHK-21 cells, indicating that the rescued virus has the ability to infect BHK-21 cells only once. WNV positive serum can neutralize the infection of the rescued virus to BHK-21 cells. The replication-deficient virus provides a technical platform for WNV neutralizing antibody detection and vaccine evaluation.
【作者單位】： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室;
【基金】：國家重點研發(fā)計劃項目(2016YFD0500403)
【分類號】：S852.65

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 劉衛(wèi)濱,梁國棟;西尼羅病毒研究進(jìn)展[J];中國病毒學(xué);2004年01期

2 陳繼明,孫映雪,王志亮,沈朝建,謝仲倫,王希明;西尼羅病毒嚴(yán)重危害中國的風(fēng)險評估[J];科學(xué)通報;2004年07期

3 趙榮樂,鄭光宇;西尼羅病毒與西尼羅熱[J];生物學(xué)通報;2005年01期

4 任軍;西尼羅病毒研究進(jìn)展[J];生命科學(xué);2005年05期

5 高志勇,莊輝;西尼羅病毒研究進(jìn)展[J];中華流行病學(xué)雜志;2005年01期

6 史利軍;呂茂民;邵長利;章金剛;;西尼羅病毒易感性研究現(xiàn)狀[J];生物技術(shù)通訊;2008年06期

7 ;美專家發(fā)現(xiàn)西尼羅病毒新變異毒株[J];中華中醫(yī)藥學(xué)刊;2009年10期

8 宋春英;;西尼羅病毒研究現(xiàn)狀[J];職業(yè)與健康;2011年12期

9 ;美國超過4500人感染西尼羅病毒183人死亡[J];疾病監(jiān)測;2012年10期

10 ;西尼羅病毒病理學(xué)[J];中國地方病防治雜志;2012年05期

相關(guān)會議論文 前10條

1 陳永金;;西尼羅病毒(West Nile Virus)[A];第三屆浙江中西部科技論壇論文集（第九卷 預(yù)防分卷）[C];2006年

2 方美玉;任瑞文;劉建偉;;西尼羅病毒病研究進(jìn)展[A];新發(fā)傳染病防治學(xué)習(xí)研討會論文集[C];2008年

3 呂茂民;章金剛;;西尼羅病毒篩查與血液相關(guān)傳播[A];中國輸血協(xié)會第四屆輸血大會論文集[C];2006年

4 孫賀庭;丁壯;;一種正在迅速蔓延的致命性病毒——西尼羅病毒[A];人畜共患傳染病防治研究新成果匯編[C];2004年

5 史利軍;尹惠瓊;呂茂民;孫宇;章金剛;;西尼羅病毒熒光定量RT-PCR檢測技術(shù)[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2009學(xué)術(shù)年會論文集（下冊）[C];2009年

6 張久松;張泮河;司炳銀;楊紅;曹務(wù)春;;西尼羅病毒與乙腦病毒生物學(xué)性狀的比較與鑒別[A];2004年中國科學(xué)院新生病毒性疾病控制學(xué)術(shù)討論會摘要集[C];2004年

7 項勛;段綱;花群義;周曉黎;董俊;楊云慶;常華;曾昭文;;西尼羅病毒的分子生物學(xué)研究進(jìn)展[A];第六屆全國會員代表大學(xué)暨第11次學(xué)術(shù)研討會論文集（上）[C];2005年

8 趙啟祖;PWMason;;表達(dá)綠色熒光蛋白的西尼羅病毒cDNA構(gòu)建及應(yīng)用[A];全國人畜共患病學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2006年

9 馬健男;楊濤;徐青元;孫恩成;林燕;步志高;吳東來;;西尼羅病毒NS1蛋白特異性單克隆抗體的制備[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)分會暨中國免疫學(xué)會獸醫(yī)免疫分會第八次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

10 項勛;段綱;花群義;周曉黎;董俊;楊云慶;常華;曾昭文;;西尼羅病毒的分子生物學(xué)研究進(jìn)展[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會第六屆全國會員代表大會暨第11次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2005年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 記者 徐啟生;西尼羅病毒肆虐得州17人喪命[N];光明日報;2012年

2 本報記者 李穎;人們該如何應(yīng)對西尼羅病毒？[N];科技日報;2012年

3 記者 鄭靈巧;西尼羅病毒不會“人傳人”[N];健康報;2012年

4 記者 鄭思　通訊員 胡辛楠 蔣麗娟;我市尚未發(fā)現(xiàn)西尼羅病毒[N];深圳商報;2012年

5 高原;美發(fā)現(xiàn)西尼羅病毒變異毒株[N];中國國門時報;2008年

6 毛磊;西尼羅病毒在美蔓延原因新解[N];中國醫(yī)藥報;2004年

7 記者王俊鳴;西尼羅病毒蔓延美國[N];科技日報;2002年

8 張亮;西尼羅病毒已成為美國地方流行病[N];科技日報;2003年

9 宋心德;科學(xué)家發(fā)現(xiàn)鳥傳播西尼羅病毒[N];光明日報;2005年

10 駐華盛頓記者 夏曉陽;美國暴發(fā)同期最嚴(yán)重西尼羅疫情[N];文匯報;2012年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前7條

1 姜淑芳;中國重要庫蚊屬蚊蟲傳播西尼羅病毒的實驗研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2006年

2 劉志國;西尼羅病毒多表位疫苗研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2007年

3 張曉龍;蚊—鳥—蚊循環(huán)在西尼羅病毒傳播中的作用研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2007年

4 史利軍;西尼羅病毒核酸及抗體檢測體系的建立與評價[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

5 李曉峰;西尼羅病毒Chin-01株5’非編碼區(qū)與病毒復(fù)制相關(guān)蛋白的相互作用研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2008年

6 張映梅;我國白紋伊蚊和埃及伊蚊傳播西尼羅病毒的實驗研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2006年

7 孫恩成;西尼羅病毒NS1蛋白對乙型腦炎病毒交叉保護(hù)作用研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 郭立平;穩(wěn)定表達(dá)西尼羅病毒prM-E蛋白細(xì)胞系的構(gòu)建[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

2 楊潔;表達(dá)西尼羅病毒囊膜糖蛋白prM/E重組新城疫病毒的構(gòu)建及其免疫原性研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

3 曹增國;西尼羅病毒快速檢測方法的建立與應(yīng)用[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2016年

4 丁細(xì)霞;西尼羅病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1特異性單克隆抗體的制備及應(yīng)用[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

5 王玉春;西尼羅病毒免疫診斷方法的建立及對入境人員的血清調(diào)查[D];河南師范大學(xué);2014年

6 曹飛;西尼羅病毒DNA形式復(fù)制子的構(gòu)建及免疫原性研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2011年

7 孫后超;西尼羅病毒E蛋白Ⅲ區(qū)的原核表達(dá)及其對西尼羅病毒感染的免疫保護(hù)作用[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2010年

8 寧北芳;乙腦病毒和西尼羅病毒單克隆抗體的制備及鑒定[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2006年

9 張翠云;西尼羅病毒E蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建以及對小鼠的免疫原性[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

10 廖玉學(xué);湖南省部分地區(qū)蝙蝠攜帶某些蚊媒病毒的調(diào)查研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2008年

，

本文編號：2302228