【摘要】：流行性乙型腦炎(Japanese encephalitis,JE)是一種危害嚴重的蚊媒性人獸共患傳染病,廣泛流行于亞洲大部分地區(qū)和西太平洋地區(qū),近年來,在澳大利亞北部和巴基斯坦的傳播表明該病的流行范圍在不斷擴大。JEV不僅嚴重威脅人類的健康,而且會對養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。建立以單克隆抗體為基礎(chǔ)的抗原抗體檢測方法則是預(yù)防控制該病毒病的重要手段。本課題組已經(jīng)構(gòu)建了穩(wěn)定表達JEV pr M-E蛋白的哺乳動物細胞系,該細胞系表達的pr M蛋白和E蛋白能夠組裝成與JEV病毒粒子具有近似構(gòu)象結(jié)構(gòu)的病毒樣顆粒(VLP)并分泌至細胞培養(yǎng)液中。本研究將該細胞系表達的JEV-VLP純化后作為免疫原,免疫6~8周齡BALB/c雌鼠,經(jīng)淋巴細胞雜交瘤融合技術(shù)、亞克隆和間接ELISA方法進行篩選后,獲得了8株能穩(wěn)定分泌JEV pr M-E蛋白特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株,分別命名為1B5、3A7、4C6、5B10、5E7、11C2、12D10、18A7。間接ELISA檢測結(jié)果表明雜交瘤細胞培養(yǎng)上清的抗體效價介于1:64~1:2 048之間,腹水的抗體效價介于1:51 200~1:204 800之間。以HBT試劑盒對單克隆抗體亞型進行鑒定,結(jié)果表明除12D10株單克隆抗體亞類為Ig G2b外,其余7株單克隆抗體亞類均為Ig G1,輕鏈均為κ鏈。Western blot和間接免疫熒光試驗(IFA)結(jié)果表明8株單克隆抗體均能夠識別JEV的天然構(gòu)象表位,5E7還能夠識別JEV的線性表位。此外,單克隆抗體4C6和12D10為JEV特異性單克隆抗體,與西尼羅病毒pr M-E抗原沒有交叉反應(yīng)。JE沒有特異治療方法,疫苗免疫是預(yù)防控制JEV感染的最為有效的措施。JEV pr M-E抗原免疫原性強,有望開發(fā)為JE亞單位疫苗。在亞單位疫苗的研發(fā)中,對疫苗抗原的檢測是重要的質(zhì)量控制技術(shù)手段。本研究從8株單克隆抗體中篩選出效價高的5B10和5E7,并將其腹水以Protein G進行了純化。以單克隆抗體5B10作為包被抗體,以單克隆抗體5E7進行辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記作為檢測抗體,并將以凝膠過濾柱層析法純化的JEV pr M-E蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)抗原,建立了JEV pr M-E蛋白抗原捕獲ELISA方法,用于定量JEV pr M-E亞單位疫苗抗原。對ELISA方法的各個條件進行優(yōu)化后,確定了以下的最佳反應(yīng)條件:包被液為50 mmol/L p H9.6碳酸鹽緩沖液,單克隆抗體5B10包被量為0.6μg/孔,4℃過夜;封閉液為0.5%聚乙烯醇(PVA),37℃封閉2 h;待檢抗原以0.5%牛血清白蛋白(BSA)稀釋,37℃反應(yīng)2 h;HRP-5E7按1:500比例稀釋,37℃作用1 h;TMB底物室溫顯色8 min。敏感性試驗表明,該方法的檢測限度為48.44 ng/m L,最佳定量范圍為0.05~1.00μg/m L,建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)能夠達到99%以上。重復(fù)性試驗表明,同一樣品的批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于10%。特異性試驗表明,該方法與其它常見豬病病原無交叉反應(yīng)。包被抗體的酶標(biāo)板可以在37℃耐受至少一個月而結(jié)合抗原能力不變。組裝的試劑盒置4℃保存1年穩(wěn)定。JEV pr M-E結(jié)構(gòu)蛋白特異性單克隆抗體的制備為新的JEV特異性抗原抗體檢測方法的研究奠定了基礎(chǔ)。同時,JEV pr M-E亞單位疫苗抗原捕獲ELISA檢測試劑盒的研制,為JEV亞單位疫苗研發(fā)過程中的質(zhì)量控制提供了技術(shù)支持與保障。單克隆抗體的制備與抗原捕獲ELISA檢測方法的建立對JE的防治與檢測具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 趙付榮;華榮虹;王斌;陳娜莎;阿合買提·買買提;步志高;;流行性乙型腦炎病毒E蛋白單克隆抗體的制備與鑒定[J];中國獸醫(yī)雜志;2010年01期

，

本文編號：2294143