【摘要】:多年來人們通過對大豆抗?fàn)I養(yǎng)因子的深入的研究,發(fā)現(xiàn)多種幼齡動物的屏障功能會受到日糧中大豆抗原蛋白的影響,限制了大豆在動物營養(yǎng)行業(yè)的利用率,進而對畜牧業(yè)的發(fā)展會產(chǎn)生一定的損失。因此本論文利用體外模擬法,選取純化的β-Conglycinin及其酶解產(chǎn)物作為致敏原,以仔豬空腸上皮細胞為(IPEC-J2)模型,研究不同濃度的β-Conglycinin及其酶解產(chǎn)物作用IPEC-J2不同時間后,檢測其跨上皮細胞吸收規(guī)律并確定其轉(zhuǎn)運方式,進而通過染料木素和果寡糖來篩選有效的吸收抑制劑的作用濃度。為進一步揭示大豆抗原蛋白的致敏機理奠定理論依據(jù)。試驗Ⅰ仔豬小腸上皮細胞對大豆抗原蛋白吸收動力學(xué)的研究本實驗分別用濃度為0、0.25、0.5、1.0 mg/mLβ-Conglycinin及其酶解產(chǎn)物處理IPEC-J2(0、2、4、8、12 h)后,收集Transwell下室的液體以及胞質(zhì)蛋白,分別用ELISA和Western blot對具有免疫活性的蛋白進行定量和定性分析,將對應(yīng)的SDS-PAGE電泳條帶切膠,用Q-E質(zhì)譜對三條蛋白質(zhì)肽段進行鑒定,結(jié)果顯示,隨著β-Conglycinin及其酶解產(chǎn)物濃度的增加,作用時間的延長,具有免疫活性的蛋白數(shù)量呈時間-劑量依賴性升高趨勢(P0.05),但隨著β-Conglycinin刺激濃度的增加及其酶解產(chǎn)作用時間的增加,胞質(zhì)中的蛋白的含量會出現(xiàn)顯著性下降(P0.05)。以上結(jié)果表明β-Conglycinin及其酶解產(chǎn)物是通過IPEC-J2胞質(zhì)后被腸道吸收,即屬于內(nèi)吞的轉(zhuǎn)運方式。為了進一步驗證β-Conglycinin及其酶解產(chǎn)物是如何通過IPEC-J2胞質(zhì)內(nèi)吞作用,本試驗將致敏原β-Conglycinin及其酶解產(chǎn)物稀釋成濃度為1 mg/mL后對細胞作用8 h,采用免疫熒光法檢測其細胞胞質(zhì)膜表面是否附著網(wǎng)格蛋白。結(jié)果表明:β-Conglycinin及其酶解產(chǎn)物處理后的細胞可見熒光沿細胞胞質(zhì)面分布,邊界清楚,呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),即屬于網(wǎng)格蛋白依賴性內(nèi)吞的轉(zhuǎn)運方式。試驗Ⅱ仔豬腸上皮細胞對大豆抗原吸收抑制物的篩選本實驗將仔豬腸上皮細胞接種在Transwell上,在濃度為1.0 mg/mL的β-Conglycinin及其酶解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中分別加入濃度為(0、6、12、18、24μg/mL)染料木素和(0、3、6、9、12μg/mL)果寡糖處理IPEC-J2 8 h后,分別收集Transwell下室的液體以及胞質(zhì)蛋白,利用ELISA和Western blot對具有免疫活性的蛋白進行定量和定性分析。結(jié)果表明:添加同一種抑制劑時,β-Conglycinin組的抑制效果低于酶解產(chǎn)物組(P0.05),同一種蛋白作為致敏原時,添加染料木素組的抑制效果明顯低于添加果寡糖組。(P0.05)。下室中的β-Conglycinin及其酶解產(chǎn)物中僅剩下分子量為25KDa的肽段,胞質(zhì)蛋白中β-Conglycinin及其酶解產(chǎn)物中存在這30KDa、25KDa的肽段;。即果寡糖能有效的抑制酶解后大豆抗原蛋白的吸收。綜上所述:β-Conglycinin及其酶解產(chǎn)物處理IPEC-J2隨著作用時間和刺激濃度的增加,蛋白通過網(wǎng)格型依賴內(nèi)吞的轉(zhuǎn)運方式跨上皮細胞后吸收量呈上升的趨勢。在此基礎(chǔ)上,添加適宜濃度的染料木素和果寡糖有助于抑制大豆抗原蛋白的吸收。以上研究結(jié)果為深入探討β-Conglycinin致敏機理提供理論依據(jù),同時也提高了大豆蛋白在動物營養(yǎng)行業(yè)的利用效率。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2016
【分類號】:S828
【參考文獻】
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本文編號:
2291160
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