【摘要】：禽流感病毒主要通過消化道和呼吸道黏膜感染并傳播,而口服免疫是一種有效的黏膜免疫方法,它可在黏膜部位直接切斷禽流感病毒的傳播途徑,從而控制禽流感的發(fā)生。目前發(fā)現(xiàn)的禽流感重組活載體疫苗,因其安全性、有效性,已經(jīng)成為未來禽流感疫苗研發(fā)的主要方向之一。本試驗(yàn)中,以枯草芽孢桿菌WB800為載體,以H5N1血凝素HA為目的基因,成功構(gòu)建了重組枯草芽孢桿菌WB800-HA和WB800-HA-SS,并通過SDS-PAGE和Western blot證實(shí)HA基因可在重組枯草芽孢桿菌中正確表達(dá)。然后在體內(nèi)試驗(yàn)中,又進(jìn)一步探討了重組枯草芽孢桿菌對(duì)雞口服免疫效力和生長(zhǎng)狀況的影響,為高致病性禽流感H5N,疫苗的研發(fā)和應(yīng)用提供新思路。將5日齡健康海藍(lán)蛋雞隨機(jī)分為6組,每組7只。10日齡首免,13日齡二免,17日齡三免。第1組口服PBS,作為空白對(duì)照組;第2組口服免疫滅活H5N1疫苗;第3組皮下注射滅活H5N1油乳佐劑疫苗,第2、3組作為陽性對(duì)照組;第4組口服免疫正�？莶菅勘U菌WB800(0.3 mL1010cfu/mL菌液/只),作為陰性對(duì)照組;第5、6組分別口服免疫表達(dá)H5N1血凝素蛋白HA的重組枯草芽孢桿菌WB800-HA及WB800-HA-SS(0.3 mL 1010cfu/mL菌液/只),作為試驗(yàn)組。通過統(tǒng)計(jì)首免后雞糞便中的枯草芽孢桿菌數(shù)量,分析其在雞腸道中的定植情況;其次,應(yīng)用間接ELISA和HI試驗(yàn)檢測(cè)禽流感重組枯草芽孢桿菌疫苗口服免疫對(duì)局部黏膜免疫和全身免疫水平的影響;最后,通過記錄各周雞的體重并應(yīng)用HE染色觀察雞腸黏膜形態(tài)學(xué)的變化,探討口服禽流感重組枯草芽孢桿菌對(duì)雞生長(zhǎng)狀況以及PP結(jié)面積的影響。試驗(yàn)結(jié)果如下:1、重組枯草芽孢桿菌在雞腸道中的定植情況首免后無菌采集各個(gè)時(shí)間點(diǎn)雞的糞便,通過形態(tài)學(xué)鑒定和16SrDNA鑒定,統(tǒng)計(jì)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的枯草芽孢桿菌的菌落數(shù),結(jié)果發(fā)現(xiàn):首免后2h開始,絕大多數(shù)枯草芽孢桿菌大量排出體外,隨后體內(nèi)殘余的枯草芽孢桿菌至48 h還能夠檢測(cè)到。2、口服禽流感重組枯草芽抱桿菌疫苗誘導(dǎo)局部黏膜體液免疫水平的檢測(cè)應(yīng)用間接ELISA的方法分別檢測(cè)首免后3、5、7周雞口腔涮洗液和第8周雞腸道和氣管涮洗液中特異性S IgA水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)WB800-HA和WB800-HA-SS疫苗組口腔和腸道涮洗液中特異性S IgA水平與空白對(duì)照組有極顯著差異(P0.01),且WB800-HA-SS組氣管涮洗液中特異性S IgA水平,顯著高于空白對(duì)照組(0.01P0.05)。結(jié)果表明這兩種禽流感重組枯草芽孢桿菌疫苗均可有效地增強(qiáng)雞消化道和呼吸道局部黏膜體液免疫水平,尤其對(duì)消化道局部黏膜體液免疫的增強(qiáng)作用更為顯著。3、口服禽流感重組枯草芽孢桿菌疫苗誘導(dǎo)全身性免疫水平的檢測(cè)血凝抑制(HI)試驗(yàn)結(jié)果顯示:首免后第1周,母源抗體水平比較高。隨著母源抗體水平的降低,首免后第4周開始,正常枯草芽抱桿菌組和兩種重組枯草芽孢桿菌組血清中特異性HI抗體效價(jià)整體上比較低。檢測(cè)首免后3、5、7周血清中特異性IgG結(jié)果顯示:重組枯草芽孢桿菌WB800-HA與WB800-HA-SS血清特異性IgG抗體水平均顯著高于空白對(duì)照組(0.01P0.05),但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于滅活疫苗組,其中WB800-HA-SS組稍高于WB800-HA組。綜合以上試驗(yàn)結(jié)果,初步判定:這兩種禽流感重組枯草芽孢桿菌疫苗均可在一定程度上增強(qiáng)機(jī)體的全身性免疫應(yīng)答。4、口服禽流感重組枯草芽抱桿菌疫苗對(duì)雞生長(zhǎng)狀況的影響記錄各周雞體重并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn):首免后的前4周,各組雞的體重相當(dāng);從首免后第5周開始各組雞的體重明顯高于空白對(duì)照組,其中正�？莶菅挎邨U菌及兩種重組枯草芽孢桿菌組雞的體重極顯著高于空白對(duì)照組(P0.01);兩種重組枯草芽孢桿菌組的雞體重高于正�？莶菅挎邨U菌,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。HE染色觀察各組雞小腸絨毛的形態(tài)結(jié)構(gòu),結(jié)果表明:小腸絨毛高度變化與體重變化趨勢(shì)一致,即重組枯草芽孢桿菌相比于空白對(duì)照組,小腸絨毛高度極顯著增加(P0.01),且WB800-HA-SS組小腸絨毛最長(zhǎng),極顯著高于其它各組(P0.01)。兩種重組枯草芽孢菌疫苗,尤其是WB800-HA-SS,可顯著促進(jìn)回腸PP結(jié)的分化、發(fā)育,增大PP結(jié)的面積(P0.01)。以上結(jié)果表明這兩種重組枯草芽孢桿菌可極顯著改善雞的生長(zhǎng)性能,并顯著增大回腸PP結(jié)面積,增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S858.31

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2287525