發(fā)布時間：2018-10-22 15:18

【摘要】：禽流感病毒主要通過消化道和呼吸道黏膜感染并傳播,而口服免疫是一種有效的黏膜免疫方法,它可在黏膜部位直接切斷禽流感病毒的傳播途徑,從而控制禽流感的發(fā)生。目前發(fā)現(xiàn)的禽流感重組活載體疫苗,因其安全性、有效性,已經(jīng)成為未來禽流感疫苗研發(fā)的主要方向之一。本試驗中,以枯草芽孢桿菌WB800為載體,以H5N1血凝素HA為目的基因,成功構(gòu)建了重組枯草芽孢桿菌WB800-HA和WB800-HA-SS,并通過SDS-PAGE和Western blot證實HA基因可在重組枯草芽孢桿菌中正確表達。然后在體內(nèi)試驗中,又進一步探討了重組枯草芽孢桿菌對雞口服免疫效力和生長狀況的影響,為高致病性禽流感H5N,疫苗的研發(fā)和應(yīng)用提供新思路。將5日齡健康海藍蛋雞隨機分為6組,每組7只。10日齡首免,13日齡二免,17日齡三免。第1組口服PBS,作為空白對照組;第2組口服免疫滅活H5N1疫苗;第3組皮下注射滅活H5N1油乳佐劑疫苗,第2、3組作為陽性對照組;第4組口服免疫正常枯草芽抱桿菌WB800(0.3 mL1010cfu/mL菌液/只),作為陰性對照組;第5、6組分別口服免疫表達H5N1血凝素蛋白HA的重組枯草芽孢桿菌WB800-HA及WB800-HA-SS(0.3 mL 1010cfu/mL菌液/只),作為試驗組。通過統(tǒng)計首免后雞糞便中的枯草芽孢桿菌數(shù)量,分析其在雞腸道中的定植情況;其次,應(yīng)用間接ELISA和HI試驗檢測禽流感重組枯草芽孢桿菌疫苗口服免疫對局部黏膜免疫和全身免疫水平的影響;最后,通過記錄各周雞的體重并應(yīng)用HE染色觀察雞腸黏膜形態(tài)學的變化,探討口服禽流感重組枯草芽孢桿菌對雞生長狀況以及PP結(jié)面積的影響。試驗結(jié)果如下:1、重組枯草芽孢桿菌在雞腸道中的定植情況首免后無菌采集各個時間點雞的糞便,通過形態(tài)學鑒定和16SrDNA鑒定,統(tǒng)計各個時間點的枯草芽孢桿菌的菌落數(shù),結(jié)果發(fā)現(xiàn):首免后2h開始,絕大多數(shù)枯草芽孢桿菌大量排出體外,隨后體內(nèi)殘余的枯草芽孢桿菌至48 h還能夠檢測到。2、口服禽流感重組枯草芽抱桿菌疫苗誘導局部黏膜體液免疫水平的檢測應(yīng)用間接ELISA的方法分別檢測首免后3、5、7周雞口腔涮洗液和第8周雞腸道和氣管涮洗液中特異性S IgA水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)WB800-HA和WB800-HA-SS疫苗組口腔和腸道涮洗液中特異性S IgA水平與空白對照組有極顯著差異(P0.01),且WB800-HA-SS組氣管涮洗液中特異性S IgA水平,顯著高于空白對照組(0.01P0.05)。結(jié)果表明這兩種禽流感重組枯草芽孢桿菌疫苗均可有效地增強雞消化道和呼吸道局部黏膜體液免疫水平,尤其對消化道局部黏膜體液免疫的增強作用更為顯著。3、口服禽流感重組枯草芽孢桿菌疫苗誘導全身性免疫水平的檢測血凝抑制(HI)試驗結(jié)果顯示:首免后第1周,母源抗體水平比較高。隨著母源抗體水平的降低,首免后第4周開始,正常枯草芽抱桿菌組和兩種重組枯草芽孢桿菌組血清中特異性HI抗體效價整體上比較低。檢測首免后3、5、7周血清中特異性IgG結(jié)果顯示:重組枯草芽孢桿菌WB800-HA與WB800-HA-SS血清特異性IgG抗體水平均顯著高于空白對照組(0.01P0.05),但遠遠低于滅活疫苗組,其中WB800-HA-SS組稍高于WB800-HA組。綜合以上試驗結(jié)果,初步判定:這兩種禽流感重組枯草芽孢桿菌疫苗均可在一定程度上增強機體的全身性免疫應(yīng)答。4、口服禽流感重組枯草芽抱桿菌疫苗對雞生長狀況的影響記錄各周雞體重并進行統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn):首免后的前4周,各組雞的體重相當;從首免后第5周開始各組雞的體重明顯高于空白對照組,其中正�？莶菅挎邨U菌及兩種重組枯草芽孢桿菌組雞的體重極顯著高于空白對照組(P0.01);兩種重組枯草芽孢桿菌組的雞體重高于正常枯草芽孢桿菌,但無統(tǒng)計學差異。HE染色觀察各組雞小腸絨毛的形態(tài)結(jié)構(gòu),結(jié)果表明:小腸絨毛高度變化與體重變化趨勢一致,即重組枯草芽孢桿菌相比于空白對照組,小腸絨毛高度極顯著增加(P0.01),且WB800-HA-SS組小腸絨毛最長,極顯著高于其它各組(P0.01)。兩種重組枯草芽孢菌疫苗,尤其是WB800-HA-SS,可顯著促進回腸PP結(jié)的分化、發(fā)育,增大PP結(jié)的面積(P0.01)。以上結(jié)果表明這兩種重組枯草芽孢桿菌可極顯著改善雞的生長性能,并顯著增大回腸PP結(jié)面積,增強機體免疫應(yīng)答。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S858.31

【參考文獻】

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本文編號：2287525