【摘要】：萊克多巴胺(ractopamine,RAC)屬于苯乙醇胺類β-受體激動劑,作為動物飼料添加劑,可以提高食用動物的瘦肉轉(zhuǎn)化率。長期或大量喂藥后,動物體內(nèi)的殘留會隨食物鏈在人體內(nèi)蓄積,造成巨大危害,威脅人類健康。目前,歐盟及中國等國家已明確禁止將此物質(zhì)添加在飼料和動物飲水中。本論文在酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)的基礎(chǔ)上,對實時熒光免疫PCR為和免疫LAMP測定萊克多巴胺的方法進行了研究,獲得了以下結(jié)果:1、借助多元酸酐法引入羧基制備萊克多巴胺半抗原(RAC-戊二酸酐半醛),后用混合酸酐方法將半抗原同載體蛋白(BSA與OVA)偶聯(lián),分別合成了免疫原RAC-BSA和包被原RAC-OVA。采用常規(guī)辦法免疫新西蘭大白兔,獲得了良好效價的多克隆抗體anti-RAC p Ab。2、混合酸酐法連接RAC與HRP。利用該酶標抗原與多克隆抗體建立了直接競爭ELISA法,以檢測萊克多巴胺殘留。結(jié)果表明,此方法IC50值為1.1ng/m L,最低檢測限(LOD)為0.19ng/m L。此方法對RAC有高特異性,同其他16種β-興奮劑的交叉反應率均在0.1%以下。實際樣品檢測時,板內(nèi)回收率在79%-94%,為可接受范圍。板內(nèi)變異系數(shù)在0.9-4.7%間,板間變異系數(shù)在3.1-5.1%,證明該方法重復性良好。3、本研究在酶聯(lián)免疫方法的基礎(chǔ)上,用熒光定量PCR作為信號檢測手段,建立實時定量免疫PCR法檢測RAC。采用PCR引物5’-端標記生物素的方法和N-羥基琥珀酰亞胺活性酯化法分別制備生物素標記DNA及生物素化多克隆抗體。以鏈霉親和素和生物素系統(tǒng)為實驗基礎(chǔ),完成抗原抗體結(jié)合的信號放大。針對反應的主要參數(shù),包括反應載體、標記抗體與抗原的濃度、親和素濃度、洗板次數(shù)、Bio-DNA濃度等因素進行優(yōu)化,最終建立rt-IPCR反應體系:選用戊二醛0.6%處理PCR管反應,以2μg/m L檢測抗原進行包被,加入0.326μg/m L生物素化抗體進行反應后,選擇濃度為2.57μg/m L親和素將生物素抗體與0.35ng的Bio-DNA結(jié)合起來,最終用PBST與dd H2O分別洗滌5次。經(jīng)檢測,該方法的最低檢測限(LOD)為0.0039ng/m L,IC50=0.18ng/m L。與競爭ELISA方法相比,提高了兩個數(shù)量級。該方法中,RAC-多克隆抗體對RAC有很高的特異性,與其他16種β-受體激動劑物質(zhì)沒有交叉反應(CR0.018%)。添加回收實驗結(jié)果表明,在RAC濃度為0.25-1.0ng/m L時,板內(nèi)回收率在80-120%,板內(nèi)及板間變異系數(shù)(CV%)小于10%。4、選擇合成的生物素化DNA設計LAMP引物,對LAMP反應體系進行優(yōu)化,確定反應體系為:0.2mmol/外引物(F3/B3),1.6mmol/L內(nèi)引物(FIP/BIP),1.4mmol/Ld NTPs,0.6MBetaine,8mmol/LMg SO4,10mmol/LKCl,20mmol/LTris-HCl,10mmol/L(NH4)2SO4,0.1%Tween 20,8U Bst DNA Polymerase,200?mol/L Calcein,500?mol/L Mn Cl2,template 2.5?L,dd H2O補足25μL。實驗結(jié)果通過SYBR Green熒光通道采用熒光定量PCR儀檢測。以梯度稀釋的Bio-DNA為模板,測得可視化LAMP檢測法的靈敏度為1.0×104 copies/μL。將此方法應用于免疫PCR核酸檢測中,最低檢測限(LOD)為0.0079ng.m L,IC50=0.41ng/m L。與競爭ELISA方法相比,提高了約一個數(shù)量級。該方法中,RAC-多克隆抗體對RAC有很高的特異性,與其他16種β-受體激動劑物質(zhì)無交叉反應(CR0.04%)。本研究在制備RAC-BSA及RAC-OVA,獲得高效價、專一性強的多克隆抗體的基礎(chǔ)上,建立了萊克多巴胺的直接競爭ELISA檢測法�；贓LISA研究,建立了萊克多巴胺的間接競爭免疫PCR法,對其各項工作指標,如特異性、準確度等進行評價。同時,初步研究了免疫LAMP技術(shù),針對靈敏度及特異性進行評估。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國計量學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S859.84

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本文編號：2287463