【摘要】：豬鏈球菌病和豬圓環(huán)病毒病流傳廣泛,危害性大,給全球的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨額的經(jīng)濟損失,妨礙了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。研究這兩種病的疫苗對其防治有著重大的意義。沙門菌是一種胞內(nèi)寄生菌,具有強大的侵襲能力,可以在宿主的體內(nèi)生長,經(jīng)過減毒后制備成疫苗載體攜帶外源抗原成為優(yōu)良的二聯(lián)菌苗,持續(xù)的刺激機體產(chǎn)生高效的細胞免疫和體液免疫應(yīng)答。本研究利用前期已經(jīng)構(gòu)建好的由阿拉伯糖調(diào)控載體菌延遲減毒和延遲表達外源抗原,提高針對豬霍亂沙門菌和外源抗原免疫原性的重組減毒沙門菌載體的基礎(chǔ)上,以Balb/C小鼠為模型,對來自豬鏈球菌的三個抗原和豬圓環(huán)病毒的二個Cap結(jié)構(gòu)蛋白的免疫原性進行了評價和篩選,為構(gòu)建有效的豬霍亂沙門菌和豬鏈球菌,豬霍亂沙門菌和豬圓環(huán)病毒二聯(lián)疫苗提供理論依據(jù)。1豬鏈球菌2型抗原的篩選和重組豬霍亂沙門菌株rSC0016攜帶豬鏈球菌抗原的免疫效率比較烯醇化酶(Enolase,Eno)是豬鏈球菌的一種毒力因子,在豬鏈球菌對宿主的入侵和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用;6-磷酸葡萄糖脫氫酶(6-phosphogluconate-dehydrogenase,6PGD)在多種細菌中具有較高的保守性,能針對豬鏈球菌的攻擊提供一定的保護力;表面抗原A(SurfaceantigenoneA,SaoA)是近年來新發(fā)現(xiàn)的豬鏈球菌高度保守的表面蛋白,在豬鏈球菌感染機體的過程中主要起到協(xié)調(diào)各種毒力因子的作用。本課題組在前期的研究中已經(jīng)成功構(gòu)建了充分減毒和提高免疫原性豬霍亂沙門菌載體rSC0016;由asd+的原核表達載體pYA3493分別表達豬鏈球菌的6PGD(pS-6PGD)和SaoA蛋白(pS-SaoA)。因此在本論文中,需要構(gòu)建由pYA3493表達豬鏈球菌的Eno蛋白,然后評價重組減毒豬霍亂沙門菌載體rSC0016分別遞送豬鏈球菌的抗原6PGD、SaoA和Eno蛋白的免疫原性。本研究根據(jù)豬鏈球菌2型(SS2,GI:8151617)的Eno基因的序列,設(shè)計擴增Eno基因(1305bp)的引物,通過酶切、連接,成功連接到原核表達載體pET28a中,成為pET28a-Eno,然后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中得到BL21(pET28a-Eno);經(jīng)IPTG誘導表達并純化獲得Eno蛋白;用純化的Eno蛋白免疫新西蘭大白兔得到抗Eno的多抗血清;將Eno基因插入asd+的原核表達載體pYA3493中形成pS-Eno質(zhì)粒;將質(zhì)粒pS-6PGD、pS-SaoA和pS-Eno分別轉(zhuǎn)化入重組減毒豬霍亂沙門菌載體rSC0016中,分別得到攜帶豬鏈球菌2型6PGD、SaoA和Eno基因的重組減毒豬霍亂沙門菌株rSC0016(pS-6PGD)、rSC0016(pS-SaoA)和 rSC0016(pS-Eno)。經(jīng) Western-Blot 檢測證明 rSC0016(pS-6PGD)、rSC0016(pS-SaoA)和rSC0016(pS-Eno)可以高效表達對應(yīng)的蛋白。同時本研究首先檢測了含有Eno的減毒豬霍亂沙門菌rSC0016(pS-Eno)在LB中的生長能力;通過口服途徑接種對其在小鼠的肝臟、脾臟以及腸道派伊爾氏淋巴結(jié)的定植能力進行了檢測;隨后分別將 rSC0016(pS-6PGD)、rSC0016(pS-SaoA)和 rSC0016(pS-Eno)三種菌苗免疫小鼠,3周后收集陰道沖洗液和血清,隨后加強免疫;5周后再次收集血清和陰道沖洗液樣品,并用豬鏈球菌2型對小鼠進行腹腔注射攻毒,評價并比較rSC0016(pS-6PGD)、rSC0016(pS-SaoA)和rSC0016(pS-Eno)的免疫原性與保護性。結(jié)果顯示,rSC0016(pS-Eno)在LB中的生長速率略慢于空載體組rSC0016(pYA3493)和商用豬霍亂沙門菌弱毒疫苗株rSC0018(pYA3493);定居實驗顯示,隨著時間的延長,rSC0016(pS-Eno)在各臟器上的細菌數(shù)量逐漸減少,接種后第14天,肝脾組織分離不到減毒菌株,而弱毒疫苗株rSC0018(pYA3493)則還可以被分離到,表明疫苗菌比弱毒疫苗株毒力更弱;疫苗菌在腸道派伊爾氏結(jié)第21天的數(shù)量仍有104CFU的菌,而rSC0018(pYA3493)在同一時間內(nèi)數(shù)量為0,表明rSC0016(pS-Eno)在腸道淋巴結(jié)的定居能力顯著高于rSC0018(pYA3493)株。使用間接ELISA檢測小鼠血清和陰道沖洗液中針對SS2的Eno、SaoA和6PGD抗原產(chǎn)生的抗體,結(jié)果顯示這三種菌苗的抗體滴度明顯高于rSC0016(pYA3493)組(P0.01),表明重組疫苗株 rSC0016(pS-Eno)、rSC0016(pS-SaoA)、rSC0016(pS-6PGD)都可以引起良好的免疫應(yīng)答。其中在首次免疫和加強免疫后,rSC0016(pS-Eno)和rSC0016(pS-SaoA)誘導的正對Eno和SaoA的IgG顯著高于rSC0016(pS-6PGD)產(chǎn)生的針對6PGD的IgG(P0.01);加強免疫后,rSC0016(pS-Eno)、rSC0016(pS-SaoA)rSC0016(pS-6PGD)在小鼠中誘導的IgA顯著高于首免產(chǎn)生的IgA,但是三種蛋白抗原誘導的IgA沒有顯著差異;在加強免疫后7d,檢測免疫小鼠肺臟和脾臟中的細胞因子IL-4和IFN-γ水平,結(jié)果是三種疫苗菌 rSC0016(pS-Eno)、rSC0016(pS-SaoA)和 rSC0016(pS-6PGD)誘導的 IL-4 和IFN-γ水平均明顯高于空載體組(P0.05)。其中,rSC0016(pS-SaoA)誘導的IL-4和IFN-γ水平均顯著 rSC0016(pS-Eno)和 rSC0016(pS-6PGD)誘導的,而 rSC0016(pS-Eno)誘導的IL-4和IFN-γ水平也顯著高于rSC0016(pS-6PGD)誘導的。動物保護性實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)24×LD50劑量的SS2腹腔注射途徑攻毒后,免疫rSC0016(pS-SaoA)和rSC0016(pS-Eno)組的小鼠的保護效率為100%,rSC0016(pYA3493)空載體組和空白對照組小鼠在24小時內(nèi)全部死亡,而免疫rSC0016(pS-6PGD)組小鼠在7天內(nèi)陸續(xù)死亡,保護效率為0。2攜帶豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的減毒豬霍亂沙門菌疫苗的構(gòu)建以及免疫效力評價Cap蛋白是豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因編碼的免疫保護性蛋白,能誘導機體產(chǎn)生中和抗體,因此cap基因是PCV2疫苗和診斷試劑的主要候選基因。本研究根據(jù)豬圓環(huán)病毒2型的ORF2的cap基因和去核定位信號的dcap基因的序列,設(shè)計擴增cap基因(702bp)和dcap基因(579bp)的引物,通過同源重組,成功構(gòu)建pET28a-Cap、pET28a-dCap,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌 BL21 得到 BL21(pET28a-Cap)和 BL21(pET28a-dCap);經(jīng)IPTG誘導、純化獲得蛋白Cap和dCap;用純化的蛋白免疫新西蘭大白兔得到兔抗Cap和dCap的多抗血清;使用同源重組方法將cap基因和去核定位信號dcap基因插入asd+原核表達載體pYA3493,獲得pS-Cap和pS-dCap質(zhì)粒;將pS-Cap和pS-dCap質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入重組減毒豬霍亂沙門菌載體rSC0016中,分別得到攜帶豬圓環(huán)病毒2型cap和dcap基因的重組減毒豬霍亂沙門菌株rSC0016(pS-Cap)和rSC0016(pS-dCap)。經(jīng)Western-Blot檢測證明rSC0016疫苗菌在多個部位能充分表達Cap和dCap蛋白。隨后,本研究首先測定了 rSC0016(pS-Cap)和rSC0016(pS-dCap)在LB培養(yǎng)基中的生長能力;通過口服免疫的方式對這兩株疫苗菌在小鼠體內(nèi)的定植能力進行了評估;隨后又以小鼠為模型評價了 rSC0016(pS-Cap)和rSC0016(pS-dCap)誘導的正對豬圓環(huán)病毒的Cap和dCap蛋白的免疫應(yīng)答水平。生長曲線的結(jié)果顯示,在培養(yǎng)后6h,rSC0016(pS-dCap)株的生長速率顯著高于rSC0016(pS-Cap)株;定居實驗顯示,隨著接種后時間的延長,rSC0016(pS-Cap)和rSC0016(pS-dCap)株在肝臟、脾臟和腸道派伊爾氏淋巴結(jié)上的細菌數(shù)量逐漸減少;接種后第14d,肝脾上分離不到疫苗株,但是在接種后第21d,腸道派伊爾氏淋巴結(jié)中的疫苗株數(shù)量仍在104CFU/g以上,并且rSC0016(pS-Cap)和rSC0016(pS-dCap)株的定居能力沒有差異;間接ELISA檢測免疫小鼠血清中抗Cap和dCap的IgG水平,結(jié)果顯示rSC0016(pS-Cap)和rSC0016(pS-dCap)株在首次免疫和加強免疫誘導的針對Cap和dCap的IgG沒有差異,并都顯著高于空載體和空白對照組(p0.01)。二免后2周,經(jīng)腹腔注射途徑,用106TCID50劑量的PCV2病毒攻毒,攻毒后14d,使用Real-timePCR的方法檢測攻毒后免疫小鼠血清中的病毒含量,以評價rSC0016(pS-Cap)和rSC0016(pS-dCap)株的保護效率。結(jié)果顯示,與空白對照組相比,rSC0016(pYA3493)的空載體組病毒含量與空白對照組相同,而免疫rSC0016(pS-Cap)和rSC0016(pS-dCap)組小鼠血清中病毒含量均顯著減少(P0.05)。表明所構(gòu)建的rSC0016(pS-Cap)和rSC0016(pS-dCap)疫苗株對豬圓環(huán)病毒可以提供較好的保護效力。其中,免疫rSC0016(pS-dCap)株的小鼠血清中病毒拷貝數(shù)顯著低于免疫rSC0016(pS-Cap)株的小鼠血清中病毒拷貝數(shù),表明rSC0016(pS-dCap)株比rSC00 16(pS-Cap)株能提供更好的保護效力。本論文通過分子克隆技術(shù),構(gòu)建了重組減毒豬霍亂沙門菌rSC0016分別表達豬鏈球菌2型的烯醇化酶Eno蛋白、豬圓環(huán)病毒的Cap和dCap蛋白的二聯(lián)疫苗候選株;使用Balb/C小鼠,分別評價了重組減毒豬霍亂沙門菌rSC0016遞送豬鏈球菌2型的三種抗原6PGD、SaoA和Eno的免疫效率,以及重組減毒豬霍亂沙門菌rSC0016遞送豬圓環(huán)病毒Cap和dCap蛋白的免疫效率;結(jié)果表明重組減毒豬霍亂沙門菌rSC0016遞送豬鏈球菌2型的SaoA和Eno蛋白的保護效率顯著高于6PGD蛋白;重組減毒豬霍亂沙門菌rSC0016遞送豬圓環(huán)病毒Cap和dCap蛋白都能誘導出較好的免疫應(yīng)答,并提供一定的保護效率。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.4

【參考文獻】

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本文編號：2284076