【摘要】：殺菌性/通透性增強(qiáng)蛋白(bactericidal/permeability increasing protein,BPI)是存在于人和哺乳動(dòng)物多形核粒細(xì)胞內(nèi)的一種陽(yáng)離子抗菌蛋白,BPI蛋白能夠特異性殺傷革蘭氏陰性菌并中和內(nèi)毒素,同時(shí),具有免疫調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、抗真菌、抗弓形蟲感染等生物學(xué)功能。目的:本研究以新疆巴什拜羊及雜交羊(盤羊♂×巴什拜羊♀)為研究對(duì)象,應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)克隆BPI N-端序列,并在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)出43KD的含有199個(gè)氨基酸的重組BPI蛋白(recombinant bectericidal/permeability increasing protein,r BPI),利用Ni2+螯合親和層析法純化后通過抑菌試驗(yàn)、凋亡誘導(dǎo)試驗(yàn)、抑制支原體試驗(yàn)、比較巴什拜羊及雜交羊之間BPIm RNA表達(dá)水平的差異,以揭示BPI蛋白的體外生物學(xué)功能。方法:(1)巴什拜羊及其雜交羊BPI基因的克隆與真核表達(dá):從巴什拜羊及其雜交羊外周血多形核粒細(xì)胞(Peripheral blood polymorphonuclear neutrophils,PMN)中提取總RNA,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出BPI N端基因片段,將其克隆至p PIC9K載體中,構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒p PIC9K-BPI,經(jīng)PCR、酶切及測(cè)序鑒定正確后,電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115中,并用0.5%甲醇對(duì)重組菌株GS115/p PIC9K-BPI進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),最后用SDS-PAGE鑒定r BPI的表達(dá)。(2)巴什拜羊及雜交羊BPI基因表達(dá)產(chǎn)物的純化:為了獲得純度較高的巴什拜羊及其雜交羊的r BPI,對(duì)巴什拜羊及其雜交羊r BPI采用Ni2+螯合親和層析法進(jìn)行純化,再用SDS-PAGE對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。(3)巴什拜羊及雜交羊r BPI的抑菌作用:將巴什拜羊及雜交羊r BPI分別加入大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌中,利用微量肉湯稀釋法檢測(cè)巴什拜羊及雜交羊r BPI對(duì)三種致病菌的抑制作用。(4)巴什拜羊及雜交羊r BPI對(duì)小鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響:在體外培養(yǎng)的小鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞(mouse brain endothelial cells,MBECs)中加入巴什拜羊及雜交羊r BPI,利用Annexin V FITC/PI染色法在熒光顯微鏡下鑒定凋亡細(xì)胞,并通過細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)凋亡率;再用凋亡試劑盒提取凋亡細(xì)胞的DNA,通過瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA ladder。(5)巴什拜羊及雜交羊r BPI對(duì)體外綿羊肺炎支原體感染的影響:向體外培養(yǎng)的綿羊肺炎支原體(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)中加入巴什拜羊及雜交羊r BPI,利用real-time PCR技術(shù)檢測(cè)MO 16S r RNA的表達(dá)水平。(6)巴什拜羊及雜交羊中性粒細(xì)胞體外表達(dá)BPI m RNA水平的檢測(cè):分別在體外分離培養(yǎng)巴什拜羊及其雜交羊的中性粒細(xì)胞,加入MO進(jìn)行感染,利用real-time PCR技術(shù)檢測(cè)巴什拜羊及其雜交羊中性粒細(xì)胞表達(dá)BPI m RNA水平的差異。結(jié)果與結(jié)論:(1)成功構(gòu)建了巴什拜羊及雜交羊BPI的真核表達(dá)載體,并且在巴斯德畢赤酵母中成功表達(dá)了分子量為43KD的巴什拜羊及雜交羊r BPI。(2)巴什拜羊及雜交羊BPI表達(dá)純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳后,觀察到較為單一的目的條帶,成功純化了巴什拜羊及其雜交羊的r BPI。(3)抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明,巴什拜羊r BPI的濃度在20μg/ml以上即可抑制大腸桿菌和沙門氏菌的生長(zhǎng),雜交羊r BPI的濃度在40μg/ml以上時(shí)能抑制大腸桿菌和沙門氏菌的生長(zhǎng),表明巴什拜羊r BPI的抑菌效果較雜交羊r BPI的抑菌效果強(qiáng),但均對(duì)G+無明顯效果。(4)Annexin V FITC/PI染色法可檢測(cè)到巴什拜羊r BPI濃度為540nmol/L(凋亡率為30.42%)、250nmol/L(凋亡率為20.46%)和180nmol/L(凋亡率為14.68%)與對(duì)照組(凋亡率3.19%)相比差異極顯著(P0.01,P0.01,P0.01),在540nmol/L的巴什拜羊r BPI誘導(dǎo)作用下可見清晰的DNA ladder條帶;雜交羊r BPI濃度為540nmol/L(凋亡率為14.76%)、250nmol/L(凋亡率為11.03%)與對(duì)照組(凋亡率3.06%)相比差異顯著(P0.05,P0.05)。(5)巴什拜羊r BPI(0.46和0.23mg/ml)在作用4h時(shí)MO 16S r RNA表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(p0.05),而雜交羊組的肺炎支原體的16S r RNA表達(dá)水平與對(duì)照組差異不顯著。說明巴什拜羊的r BPI對(duì)綿羊肺炎支原體可起到抑制作用,而雜交羊的r BPI對(duì)綿羊肺炎支原體無明顯抑制作用。(6)在MO感染后4h至8h,巴什拜羊試驗(yàn)組的中性粒細(xì)胞BPI m RNA表達(dá)水平顯著高于巴什拜羊?qū)φ战M和雜交羊試驗(yàn)組(P0.05,P0.05),說明MO的感染能夠顯著提高巴什拜羊中性粒細(xì)胞表達(dá)BPI m RNA的水平,而雜交羊中性粒表達(dá)BPI m RNA水平上升不明顯。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S826

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2282602