【摘要】：雞大腸桿菌病是由雞致病性大腸桿菌（Avian pathogenic Escherichia coli，APEC）引起的一種局部或全身性疾病，一年四季均可爆發(fā)，可導(dǎo)致敗血癥、氣囊炎、輸卵管炎、蜂窩織炎等多種癥狀。APEC含有171個(gè)血清型，其中O78是亞洲最常見(jiàn)血清型之一。APEC含有許多毒力因子，包括攝鐵螯合蛋白D（IucD），鐵調(diào)節(jié)蛋白2（Irp-2），1型菌毛A（FimA），1型菌毛C（FimC），P型菌毛C（PapC），溫度敏感血凝素(Tsh)，溶血素E（HlyE），血清存活因子（Iss），外膜蛋白A（OmpA）以及自轉(zhuǎn)運(yùn)空泡毒素（Vat）等。這些毒力因子與細(xì)菌鐵攝取、代謝、黏附和侵入以及血清生存有關(guān)，而且這些毒力因子的表達(dá)可能與群體感應(yīng)（Quorum sensing，QS）的調(diào)控密切相關(guān)。APEC感染開(kāi)始于上呼吸道，通過(guò)破壞氣-血屏障進(jìn)入血液循環(huán)而到達(dá)全身，最終導(dǎo)致敗血癥的產(chǎn)生。其中雞肺II型上皮細(xì)胞在維持氣-血屏障功能方面具有重要的作用，是APEC突破氣-血屏障的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。穿心蓮內(nèi)酯（Andrographolide）是穿心蓮的主要活性成分之一，具有抗炎、抗菌和抗病毒活性。此外，穿心蓮內(nèi)酯對(duì)綠膿桿菌QS系統(tǒng)具有抑制活性。因此，本研究我們主要探討在雞致病性大腸桿菌O78（APEC-O78）造成雞肺II型上皮細(xì)胞損傷過(guò)程中，QS系統(tǒng)的自誘導(dǎo)信號(hào)分子2（autoinducer-2，AI-2）所發(fā)揮的作用；并初步分析穿心蓮內(nèi)酯是否能夠通過(guò)干擾APEC-O78的QS系統(tǒng)抑制APEC-O78對(duì)雞肺II型上皮細(xì)胞的損傷作用。 首先，通過(guò)收集APEC-O78上清，并與的哈維弧菌BB170（Vibrio harveyiBB170，V. harveyi BB170）共培養(yǎng)，檢測(cè)V. harveyi BB170發(fā)光間接檢測(cè)AI-2的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雞致病性大腸桿菌APEC-O78具有分泌AI-2的能力，發(fā)光量與接種的APEC-O78上清量及共培養(yǎng)時(shí)間具有正相關(guān)性。APEC-O78分泌AI-2的量隨其生長(zhǎng)曲線發(fā)生改變，對(duì)數(shù)期AI-2分泌迅速上升，對(duì)數(shù)末期達(dá)到最大，但進(jìn)入平臺(tái)期后，AI-2分泌量迅速下降，直至衰亡期。 在雞致病性大腸桿菌黏附雞肺II型上皮細(xì)胞的模型基礎(chǔ)上，我們采用乳酸脫氫酶活性（Lactate dehydrogenase，LDH）檢測(cè)法、臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)、涂板法、RT-PCR法等，研究APEC-O78能造成雞肺II型上皮細(xì)胞損傷過(guò)程中，QS系統(tǒng)的AI-2所發(fā)揮的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，APEC-O78（107-109CFU/mL）均能誘導(dǎo)雞肺II型上皮細(xì)胞損傷，且與接種107和109CFU/mL APEC-O78組相比較，108CFU/mL組APEC-O78能造成雞肺II型上皮細(xì)胞更嚴(yán)重的損傷。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明APEC-O78引起的細(xì)胞損傷具有細(xì)菌密度依賴性。隨后的RT-PCR研究結(jié)果也表明，與接種108CFU/mLAPEC-O78相比較，107CFU/mL APEC-O78組和109CFU/mL APEC-O78組中APEC-O78毒力基因分泌顯著降低。以上結(jié)果表明APEC-O78誘導(dǎo)雞肺II型上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)損傷及細(xì)胞死亡率，LDH釋放，APEC-O78毒力基因mRNA的表達(dá)均與AI-2的釋放量呈正相關(guān)性。 為了分析穿心蓮內(nèi)酯能否通過(guò)干擾APEC-O78的QS系統(tǒng)抑制APEC-O78對(duì)雞肺II型上皮細(xì)胞的損傷作用，我們采用電鏡、激光共聚焦等方法進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，低于最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的穿心蓮內(nèi)酯能夠顯著降低APEC-O78誘導(dǎo)雞肺II型上皮細(xì)胞LDH釋放（P0.05），，F(xiàn)-actin骨架重排，顯著降低APEC對(duì)雞肺II型上皮細(xì)胞的粘附率（P0.05）。我們還發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內(nèi)酯（10μg/mL）能顯著降低APEC-O78AI-2的分泌（P0.05）。此外，雞肺II型上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)損傷、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷，細(xì)胞死亡率，APEC-O78毒力基因mRNA的表達(dá)均與穿心蓮內(nèi)酯（10μg/mL）抑制APEC-O78AI-2釋放的結(jié)果一致。 綜上所述，AI-2作為APEC-O78的QS關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在APEC-O78誘導(dǎo)雞肺II型上皮細(xì)胞損害過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。而穿心蓮內(nèi)酯可能夠作為APEC-O78的一種群體感應(yīng)抑制劑（Quorum sensing inhibitor，QSI），降低APEC-O78AI-2分泌，且其降低APEC-O78誘導(dǎo)的雞肺II型上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)損傷、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷等與抑制AI-2的釋放結(jié)果一致。這為今后研究穿心蓮內(nèi)酯治療雞大腸桿菌病提供了分子生物學(xué)基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.61

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2278977