【摘要】：兔病毒性出血癥(viral haemorrhagic disease of rabbits)是由兔出血癥病毒(rabbit haemorrhagic disease virus,RHDV)感染所引起的兔的一種急性、敗血性、高度接觸傳染性、高致死性的傳染性疾病,以全身實(shí)質(zhì)器官出現(xiàn)水腫、淤血和出血為主要特征。RHDV被分為G1~G5以及G6(RHDVa,又名RHDV抗原變異株)6種基因型。2010年首次報(bào)道了變異型RHDV,它在遺傳特性上與RHDV的6個(gè)基因型有很大的差異,命名為RHDV2也稱為RHDVb。在歐洲野兔體內(nèi),發(fā)現(xiàn)一個(gè)能引起野兔發(fā)病的新型毒株與RHDV的基因組結(jié)構(gòu)類似,被稱為歐洲褐色兔綜合癥病毒(EBHSV)。本試驗(yàn)利用RHDV病原建立了RHDV重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)檢測方法,通過生物信息學(xué)分析,將RHDV的VP60基因進(jìn)行分段表達(dá)確定其抗原性,以此建立了間接ELISA方法。本研究主要包括以下四部分內(nèi)容:1 RHDV毒株的分離與分子遺傳變異特性分析在山東不同地區(qū)分離了3株RHDV毒株,分別命名為BZ/2015株、LW/2015株和MY/2015株,克隆RHDV病毒的VP60蛋白基因,通過VP60核酸序列進(jìn)化樹分析顯示,3個(gè)毒株均屬G6(RHDVa)變異群,序列同源性比對分析顯示,BZ/2015株、LW/2015株和MY/2015株與Genbank中其它經(jīng)典型RHDV毒株核苷酸序列同源性分別在90.2%~98.6%、90.5%~99.9%、89.4%~99.5%,BZ/2015株、LW/2015株和MY/2015株與Genbank中RHDV2毒株核苷酸序列同源性分別在82.6%~82.9%、82.5%~82.8%、81.5%~81.9%。2014年河北分離到HB毒株與1984年江蘇首次分離的WX84毒株遺傳距離很近,推測其很可能來自毒株WX84株,近幾年,中國從西北、華東、東北和西南四大地區(qū)分離到的具有代表性的RHDV毒株與WX84株差異較大,說明RHDV發(fā)生了變異,但是四大地區(qū)之間的RHDV毒株差異不大,且同世界其他國家和地區(qū)RHDV分離株基因序列幾乎沒有差異,同源性達(dá)到90%以上,因此,病毒基因型和流行的地域性沒有必然聯(lián)系。2 RPA檢測方法的建立根據(jù)BZ/2015株的VP60基因的核酸序列,設(shè)計(jì)1對特異性引物,優(yōu)化反應(yīng)條件,建立了RHDV重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增檢測方法。通過敏感性、特異性、人工感染和臨床應(yīng)用等表明,該方法能特異擴(kuò)增出特異片段,檢測靈敏度達(dá)到0.1 LD50,與常規(guī)一步法RT-PCR敏感性相同。該方法具有較好的穩(wěn)定性、敏感性和特異性。重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)過程總耗時(shí)30 min左右,RPA檢測方法和一步法RT-PCR的檢出符合率為100%。3 VP60基因分段表達(dá)及抗原性分析VP60基因分為3個(gè)區(qū)域VP60-1(2aa-208aa)、VP60-2(174aa-425aa)和VP60-3(342aa-579aa)。VP60-1、VP60-2、VP60-3和VP60分別克隆到原核表達(dá)載體pET32a(+)和pColdⅢ中,4個(gè)重組質(zhì)粒分別命名為pET-VP60-1、pET-VP60-2、pET-VP60-3和pCold-VP60。對VP60-1、VP60-2、VP60-3和VP60基因進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá),重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析。SDS-PAGE結(jié)果顯示表達(dá)的重組蛋白VP60-1、VP60-2、VP60-3和VP60條帶大小,與預(yù)期大小一致。將表達(dá)的重組蛋白純化后的蛋白進(jìn)行Western blot檢測結(jié)果表明,表達(dá)的重組蛋白VP60-1、VP60-2、VP60-3和VP60均能和RHDV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。4 ELISA方法建立利用純化的VP60分段蛋白作為包被抗原,以兔出血癥病毒陽性血清為一抗,HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗建立間接ELISA檢測方法。分別用ELISA方法和HI試驗(yàn)對7只6周齡SPF兔免疫RHD滅活疫苗后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d的抗體水平進(jìn)行檢測,間接ELISA結(jié)果顯示,重組蛋白VP60-1和VP60作為包被抗原檢測兔免疫后血清中的抗體消長規(guī)律一致。HI試驗(yàn)和以VP60-1作為包被抗原的間接ELISA試驗(yàn)檢測結(jié)果一致,本試驗(yàn)根據(jù)兩種方法所測得的各組兔群的抗體效價(jià)建立了相應(yīng)的回歸方程r2=0.9547,表明ELISA方法與HI試驗(yàn)檢測的抗體效價(jià)結(jié)果呈顯著相關(guān)性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.65

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8 周q，

本文編號：2275726