【摘要】：2010年以來,貴州省部分地區(qū)規(guī)�；B(yǎng)豬場豬群出現(xiàn)不同程度的腹瀉,部分養(yǎng)豬場采用豬流行性腹瀉-豬傳染性胃腸炎二聯(lián)滅活疫苗進(jìn)行緊急免疫,但效果甚微。為弄清仔豬病毒性腹瀉在貴州省的流行情況,筆者主要開展了仔豬病毒性腹瀉病原快速檢測方法的建立、貴州省仔豬病毒性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查及相關(guān)基因分析的研究,研究結(jié)果為貴州省仔豬病毒性腹瀉的診斷、治療和疫苗研究提供重要依據(jù)。1.PEDV、TGEV和RV RT-PCR檢測方法的建立與臨床應(yīng)用:本研究根據(jù)Genbank提供的PEDV、TGEV和RV基因參考序列,設(shè)計三對特異性引物,以PEDV-TGEV-RV三聯(lián)疫苗RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板,分別建立PEDV、TGEV和RV RT-PCR檢測方法,并對其進(jìn)行了反應(yīng)條件的優(yōu)化。結(jié)果顯示,PEDV、TGEV和RV擴(kuò)增長度分別為651bp、859bp、309bp,與預(yù)期大小相符;PEDV、TGEV和RV RT-PCR反應(yīng)體系最佳退火溫度均為53℃,最適引物濃度為10 nmol/μL;PEDV、TGEV和RV最低cDNA模板檢出濃度分別為1.28×10-8g/L,0.36×10-7g/L,2.6×10-9 g/L,特異性、敏感性良好,能夠用于臨床檢測。2.貴州省仔豬病毒性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查:(1)采用常規(guī)流行病學(xué)方法對貴州省部分規(guī)模化養(yǎng)豬場進(jìn)行仔豬病毒性腹瀉發(fā)病狀況調(diào)查、免疫狀況調(diào)查、臨床癥狀與大體病變觀察。結(jié)果表明,2013年~2014年的5個州(市)13個規(guī)模養(yǎng)豬場,豬群發(fā)生腹瀉性疾病多在12月至翌年5月,發(fā)病率為70.35%(3020/4293),病死率為76.16%(2300/3020)。(2)用ELISA方法對貴州省2013~2014年收集的7個地州(市)20個規(guī)模養(yǎng)豬場184份血清樣本進(jìn)行PEDV、TGEV和RV抗體檢測。結(jié)果顯示:PEDV、TGEV和RV血清總體陽性率分別為39.13%、33.70%和42.39%;PEDV、TGEV和RV免疫抗體陽性率分別為44.05%、32.14%、46.43%;未免疫豬群PEDV、TGEV和RV抗體陽性率為35.00%、35.00%、39.00%。(3)采用RT-PCR方法對111份臨床疑似病毒性腹瀉樣本進(jìn)行PEDV、TGEV和RV病原核酸檢測。結(jié)果顯示:PEDV、TGEV和RV的核酸檢出率分別為82.88%(92/111)、1.80%(2/111)和10.81%(12/111);PEDV與TGEV混合感染陽性率為0.02%(2/111),PEDV與RV混合感染陽性率為10.81%(12/111)。以上結(jié)果說明,我省養(yǎng)殖場存在PEDV、TGEV和RV隱性感染的情況。3.豬流行性腹瀉病毒(PEDV)分子流行病學(xué)調(diào)查:參考GenBank登錄的PEDV比利時毒株CV777株(NO.AF353511)基因序列,針對S、M和ORF3基因設(shè)計特異性引物,采用RT-PCR方法,擴(kuò)增目的基因,并進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、克隆和測序分析,并利用DNAStar、MEGA5.0軟件對貴州省地方流行株S、M和ORF3的基因序列進(jìn)行遺傳演化分析。結(jié)果顯示,本研究成功克隆6株毒株的S、M和ORF3基因,遺傳變異分析如下:(1)6株貴州地方流行株S基因的全長為均為4161bp,編碼1387個氨基酸,核苷酸與氨基酸同源性分別在98.0%~99.1%和97.3%~100%之間;與國內(nèi)外PEDV參考毒株核苷酸同源性在91.8%~93.9%之間,氨基酸同源性在91.3%~99.3%之間。與參考毒株CV777相比,6株地方流行株S基因存在420個堿基突變,在175~186,417~419共有15個堿基的插入,在481位~486位共同缺失5個堿基。(2)6株地方流行株M基因全長均為681bp,編碼226個氨基酸;核苷酸與氨基酸之間的同源性分別在99.9%~100%和97.8%~99.6%之間;與國內(nèi)外的PEDV參考毒株核苷酸的同源性在97.8%~98.2%之間,氨基酸同源性在97.8%~98.2%之間。M基因的核苷酸序列出現(xiàn)部分點突變,無插入和缺失,氨基酸序列無變化,說明M基因保守性高。(3)6株地方流行株ORF3基因全長為675bp,編碼225個氨基酸,核苷酸與氨基酸之間的同源性分別在99.0%~100%和98.2%~99.6%之間;與國內(nèi)外的毒株核苷酸的同源性在96.1%~98.5%之間,氨基酸同源性在95.6%~99.1%之間。與CV777毒株序列相比,流行毒株ORF3基因存在29處點突變,無堿基的缺失和插入。進(jìn)化樹分析,6株流行毒株與CV777株、美國毒株和韓國毒株親緣關(guān)系較近,與LZC、Brl/87親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。結(jié)論:1.本試驗成功建立了PEDV、TGEV和RV的RT-PCR檢測方法,敏感性高、特異性好能夠用于臨床診斷。2.經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查顯示,貴州省部分規(guī)模養(yǎng)豬場存在不同程度豬病毒性腹瀉感染,且主要病原為PEDV;血清學(xué)調(diào)查表明貴州省豬群腹瀉疫病的免疫效果較差,存在隱性感染的情況。3.對PEDV病毒S、M和ORF3三個基因的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明,貴州省PEDV地方流行株分為兩群,與韓國毒株、越南毒株和美國毒株親緣關(guān)系近;而與LZC、Brl/87親緣關(guān)系遠(yuǎn)。從S和ORF3基因的遺傳變異分析,推測貴州流行株為PEDV變異強(qiáng)毒株。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S858.28

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本文編號：2266210