【摘要】：輪狀病毒(Rotavirus,RV)屬于呼腸孤病毒科,輪狀病毒屬,是引起幼畜病毒性腸炎、腹瀉的的主要病原之一,對(duì)我國養(yǎng)豬業(yè)危害巨大,神經(jīng)節(jié)苷酯GM3是其主要受體之一。為了探討食淀粉乳桿菌(Lactobacillus amylovorus)在抗豬輪狀病毒(Procine Rotavirus,PRV)作用中GM3的調(diào)節(jié)機(jī)制,本研究分別完成了食淀粉乳桿菌體外抗RV能力分析;食淀粉乳桿菌體內(nèi)對(duì)RV感染小鼠乳鼠的相關(guān)效應(yīng)和乳鼠空腸神經(jīng)節(jié)苷脂GM3變化規(guī)律等兩方面研究,旨在闡明食淀粉乳桿菌抗RV部分機(jī)制。本研究分為體外和動(dòng)物體內(nèi)兩個(gè)部分。體外實(shí)驗(yàn)以IPEC-J2細(xì)胞為細(xì)胞平臺(tái)、MTT法為檢驗(yàn)方法分析食淀粉乳桿菌體外抗RV能力;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)選擇中國昆明鼠乳鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,檢測食淀粉乳桿菌體內(nèi)對(duì)RV感染小鼠乳鼠的相關(guān)效應(yīng),進(jìn)一步檢測了乳鼠空腸神經(jīng)節(jié)苷脂GM3變化規(guī)律和上述效應(yīng)相關(guān)性。一、體外試驗(yàn)部分。主要包括食淀粉乳桿菌上清液抗RV能力穩(wěn)定性研究和益生菌共培養(yǎng)上清液抗RV能力測定兩個(gè)方面:1.食淀粉乳桿菌上清液抗RV能力穩(wěn)定性研究:連續(xù)將食淀粉乳桿菌傳代25次,每隔3代測定其上清抗RV能力,測定結(jié)果顯示:各代食淀粉乳桿菌對(duì)RV抑制率差異不顯著,表明該株食淀粉乳桿菌菌株抗RV能力較為穩(wěn)定,具有較為良好的傳代穩(wěn)定性。2.益生菌共培養(yǎng)上清液抗RV能力測定:選取食淀粉乳桿菌和抗RV能力不等的4株屎腸球菌為實(shí)驗(yàn)材料,探究該株食淀粉乳桿菌與不同株屎腸球菌共培養(yǎng)后,共培養(yǎng)上清液抗RV能力與單獨(dú)食淀粉上清液及單獨(dú)屎腸球菌上清液抗RV能力間的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:z4、z5和z8與食淀粉乳桿菌混合培養(yǎng)后上清液抗RV能力,介于單獨(dú)食淀粉乳桿菌和單獨(dú)z4、z5和z8上清液抗RV能力之間,差異不顯著(p0.05)。z7和食淀粉乳桿菌共培養(yǎng)上清液對(duì)RV抑制率均低于單獨(dú)屎腸球菌上清及單獨(dú)食淀粉乳桿菌上清。說明該株食淀粉乳桿菌有良好的共培養(yǎng)穩(wěn)定性。二、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分。主要包括食淀粉乳桿菌體內(nèi)對(duì)RV感染小鼠乳鼠的相關(guān)效應(yīng)和食淀粉乳桿菌對(duì)乳鼠空腸神經(jīng)節(jié)苷脂GM3作用兩方面。試驗(yàn)乳鼠分為4組:正常組、病毒組、先灌胃益生菌后攻毒組-食淀粉組(Gavaged probiotic before inoculation group,BI group)和先攻毒后灌胃益生菌組-治療組(Gavaged probiotic after inoculation group,AI group),26只每組,共飼喂11天(d),從1d開始BI組每只每天灌胃50μL益生菌活菌液(106cfu/mL),其他組每只每天飼喂等量PBS,病毒組、BI組和AI組4d時(shí)每只小鼠飼喂毒力為10-6.28TCID50/mL輪狀病毒50μL,AI組在4d時(shí)每天灌胃50μL益生菌活菌液(106cfu/mL)。1.食淀粉乳桿菌體內(nèi)對(duì)RV感染小鼠乳鼠的相關(guān)效應(yīng):感染RV乳鼠的體重增長率升降、糞樣病毒量多少和空腸黏膜組織學(xué)變化。(1)體重增長率測定結(jié)果顯示:飼喂1d~4d時(shí)各組體重增長率差異不顯著(p0.05);飼喂4d~11d時(shí)正常組體重增長率顯著高于其他組別(p0.05);攻毒前后飼喂食淀粉乳桿菌,乳鼠體重增長率仍會(huì)出現(xiàn)一定程度的降低;BI組及AI組體重增長率顯著高于病毒組(p0.05),BI組和AI組體重增長率差異不顯著(p0.05)。(2)糞樣病毒量測定結(jié)果顯示:感染后2d、3d、4d、5d及7d時(shí)BI組RV含量均顯著低于病毒組(p0.05);AI組在感染后4d時(shí)RV含量顯著低于病毒組(p0.05),其他時(shí)間點(diǎn)差異不顯著。(3)空腸黏膜組織學(xué)變化結(jié)果顯示:病毒組小腸上皮細(xì)胞出現(xiàn)輕微空泡變性,小腸絨毛內(nèi)部組織缺失較為嚴(yán)重,絨毛上皮細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著變化,BI組及AI相對(duì)于病毒組,相關(guān)癥狀明顯減輕;BI組空腸絨毛長度在攻毒后1d和3d時(shí)顯著高于病毒組(p0.05),和正常組差異不顯著(p0.05);AI組空腸絨毛長度大于病毒組,但差異不顯著(p0.05);攻毒后5d、7d時(shí)各組絨毛長度差異不顯著(p0.05)。2.食淀粉乳桿菌對(duì)乳鼠空腸神經(jīng)節(jié)苷脂GM3影響實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)方面:乳鼠空腸組織GM3定量ELISA檢測和乳鼠空腸組織GM3合成酶m RNA檢測。(1)乳鼠空腸組織GM3定量ELISA檢測結(jié)果顯示,攻毒前:2d~4d時(shí)BI組及正常組差異不顯著(P0.05),攻毒后:5d、9d及11d時(shí)BI組神經(jīng)節(jié)苷酯GM3含量顯著高于正常組及病毒組(P0.05);9d時(shí)病毒組神經(jīng)節(jié)苷酯GM3含量顯著高于正常組(P0.05);AI在5d和11d時(shí)顯著高于病毒組(p0.05),AI組在9d和11d時(shí)顯著低于BI組。(2)乳鼠空腸組織GM3合成酶Mus St3gal5mRNA結(jié)果顯示:攻毒前,BI組與正常組在2d、3d、4d時(shí)均差異不顯著(p0.05),攻毒后,5d、9d時(shí)病毒組水平顯著低于正常組(p0.05);7d、9d及11d時(shí)BI組水平顯著低于病毒組(p0.05);5d、7d時(shí)AI組水平略低于病毒組(p0.05)。(3)乳鼠空腸組織GM3合成酶Mus UGCGm RNA結(jié)果顯示:攻毒前,3d時(shí)BI組與正常組差異不顯著(p0.05),攻毒后:7d、9d時(shí)病毒組水平均顯著低于正常組(p0.05);7d、9d、10d時(shí)BI組水平顯著低于正常組及病毒組(p0.05),11d時(shí)AI組水平顯著低于病毒組(p0.05)。綜上所述連續(xù)25代培養(yǎng)以及與4株屎腸球菌共培養(yǎng)后,該株食淀粉乳桿菌其抗RV能力仍然保持相對(duì)的穩(wěn)定性。該株食淀粉乳桿菌接種RV感染前后的乳鼠,其小腸上皮細(xì)胞中RV受體神經(jīng)節(jié)苷酯GM3,在RV感染前與正常組一致,在RV感染后明顯升高;顯著減少乳鼠糞便中RV含量、減輕RV對(duì)乳鼠小腸絨毛損傷、抑制小腸隱窩增生、改善體重增長率的降低。
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【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S855.3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2264890