【摘要】：根據(jù)GenBank中已公布的豬德爾塔冠狀病毒(PDCoV)N基因序列設計并合成特異的引物和TaqMan探針,構建質粒標準品,以標準品為模板建立了檢測PDCoV的TaqMan實時熒光定量PCR方法,并對該方法的敏感性、特異性及重復性進行了評價。結果顯示,以豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬庫布病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和口蹄疫病毒為模板時均未檢測到熒光信號,表明該方法具有良好的特異性;用2.66×10~6、2.66×10~5和2.66×10~4copies/L這3個不同濃度的質粒標準品進重復試驗,循環(huán)閾值Ct的變異系數(shù)均低于2%,表明該方法具有良好的特異性;標準曲線斜率為-3.461,相關系數(shù)為R~2=0.998,表明閾值和模板濃度之間具有良好的線性關系。10倍梯度稀釋質粒標準品,檢測的最低限度為2.66×10~1 copies/L的質粒DNA,表明此方法具有良好的敏感性。利用該方法對194份臨床豬糞便樣品進行了檢測,結果顯示PDCoV陽性率為22.1%,明顯高于常規(guī)RT-PCR的11.9%,表明該方法可應用于PDCoV的臨床診斷及定量檢測。
[Abstract]:According to the published (PDCoV) N gene sequence of porcine Delta coronavirus (GenBank), specific primers and TaqMan probes were designed and synthesized to construct the standard plasmid. A real-time TaqMan quantitative PCR method for detecting PDCoV was established. The sensitivity, specificity and repeatability of the method were evaluated. The results showed that fluorescent signals were not detected using porcine epidemic diarrhea virus, porcine transmissible gastroenteritis virus, porcine Kub virus, porcine reproductive and respiratory syndrome virus and foot-and-mouth disease virus as templates. The coefficient of variation of circulating threshold Ct was lower than that of 2.66 脳 10 ~ 6 脳 10 ~ (5) and 2.66 脳 10~4copies/L plasmids. The results showed that the method had a good specificity and the coefficient of variation of circulating threshold Ct was lower than that of 2.66 脳 10 ~ (6) and 2.66 脳 10 ~ (6) 10~4copies/L. The slope of the standard curve was -3.461, and the correlation coefficient was 0.998. The results showed that there was a good linear relationship between the threshold value and the concentration of template, and the standard sample was diluted by gradient. The detection of plasmid DNA, with a minimum limit of 2.66 脳 10 ~ (-1) copies/L showed that the method had a good sensitivity. The results showed that the positive rate of PDCoV was 22.1, which was significantly higher than that of routine RT-PCR (11.9%), which indicated that this method could be applied to the clinical diagnosis and quantitative detection of PDCoV.
【作者單位】： 甘肅農(nóng)業(yè)大學生命科學技術學院;中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室;
【基金】：國家自然科學基金項目(31602095) 國家生豬產(chǎn)業(yè)體系項目(CARS-36-068) “十三五”國家重點研發(fā)計劃(2016YFD0501505) 蘭州獸醫(yī)研究所統(tǒng)籌項目(Y2016CG23)
【分類號】：S852.651

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 李富祥;段志華;趙文華;信愛國;楊仕標;李華春;;鼻氣管鳥桿菌TaqMan熒光定量PCR檢測方法的建立[J];中國預防獸醫(yī)學報;2014年02期

2 霍紅;李業(yè)南;薛遙;郭立平;王曉磊;步志高;華榮虹;;豬流行性乙型腦炎病毒TaqMan熒光定量PCR方法的建立[J];中國預防獸醫(yī)學報;2014年07期

3 季新成;史茜;郭春娟;王科珂;冉多良;;牛病毒性腹瀉病毒內標雙重TaqMan熒光RT-PCR方法的建立及初步應用[J];中國預防獸醫(yī)學報;2014年08期

4 鄭衛(wèi)東,鄭懷競,楊澤,從冠寧;通用TaqMan探針技術在apoE基因3937T/C單核苷酸多態(tài)性檢測中的應用[J];臨床檢驗雜志;2004年03期

5 崔銀秋;張全超;謝承志;周慧;;新型TaqMan-MB熒光探針測定古DNA模板含量[J];吉林大學學報(醫(yī)學版);2007年01期

6 周倫江;王隆柏;方桂友;魏宏;車勇良;陳如敬;莊向生;;變異型豬繁殖與呼吸綜合征病毒TaqMan熒光定量RT-PCR方法的建立與初步應用[J];中國獸醫(yī)學報;2010年08期

7 劉毅;吳志明;閆若潛;趙明軍;王東方;趙雪麗;劉梅芬;程俊貞;薛曉;李寧;;犬細小病毒TaqMan MGB熒光定量PCR檢測方法的建立及應用[J];中國畜牧獸醫(yī);2014年06期

8 栗冬梅;宋秀平;王君;劉起勇;;TaqMan-MGB探針檢測文森巴爾通體博格霍夫亞種實時熒光定量PCR方法的建立及應用[J];微生物學報;2013年09期

9 萬春和;程龍飛;邵周伍林;劉思國;黃瑜;張云;;鴨疫里默氏桿菌TaqMan熒光定量PCR檢測方法的建立[J];中國預防獸醫(yī)學報;2014年06期

10 曹偉偉;郭抗抗;許信剛;寧蓬勃;劉偉;程敏;董玲娟;徐磊;高婉俊;任敏;;豬圓環(huán)病毒Ⅱ型TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法的建立與應用[J];西北農(nóng)林科技大學學報(自然科學版);2013年01期

相關會議論文 前3條

1 Songhong Wei;Theo van der Lee;Richard van Hoof;Marga van Gent-Pelzer;Els verstappen;Cees Waalwijk;Zhiheng Liu;;Quantitative detection of Fusarium graminearum and its chemotypes by TaqMan PCR[A];中國菌物學會第六屆會員代表大會（2014年學術年會）暨貴州省食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展高峰論壇會議摘要[C];2014年

2 高志強;宋立;張鶴曉;寧宜寶;喬彩霞;楊承槐;吳丹;谷強;;豬鏈球菌通用及2型TaqMan熒光PCR檢測技術建立與應用[A];京津冀畜牧獸醫(yī)科技創(chuàng)新交流會暨新思想、新觀點、新方法論壇論文集[C];2008年

3 李文濤;李文潔;劉淑清;汪洋;楊昆;鄒浩勇;何啟蓋;;豬圓環(huán)病毒2型TaqMan熒光定量PCR檢測方法的建立[A];中國畜牧獸醫(yī)學會2010年學術年會——第二屆中國獸醫(yī)臨床大會論文集(上冊)[C];2010年

相關碩士學位論文 前4條

1 李建;牛支原體TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法的研究[D];內蒙古農(nóng)業(yè)大學;2016年

2 霍紅;流行性乙型腦炎病毒TaqMan熒光定量PCR檢測方法的建立及應用[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2014年

3 丁維民;TaqMan-MGB探針雙重熒光定量PCR方法絕對定量MDV-Ⅰ和HVT[D];安徽農(nóng)業(yè)大學;2009年

4 李霞;CAEV TaqMan PCR檢測及重組SU蛋白的真核表達[D];天津大學;2012年

，

本文編號：2252770