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黑龍江畜牧獸醫(yī) 1997 年第 9 期

專　論 　與　 綜　述

　　分子生物學(xué)技術(shù)在獸醫(yī)細(xì)菌學(xué)研究中的 　　　　　　應(yīng)用現(xiàn)狀及前景 　　　　　王　玲　張紹學(xué)　柴家前
　　　　　　 ( 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)科院?泰安?271018)

　　近 20 年來, 生物科學(xué)取得了驚人的進(jìn)步, 尤

其是以分子生物學(xué)為標(biāo)志的現(xiàn)代生物學(xué), 它是從 分子水平上研究和解釋一切生物現(xiàn)象, 并在分子 水平上改造和利用生物的一門新興學(xué)科。

　　分子雜交技術(shù)主要是以 DNA 復(fù)性和變性為 理論基礎(chǔ), 可分為 Sou thern 雜交、 o rthern 雜交、 N 斑點(diǎn)雜交和原位雜交 4 種方法。Sou thern 雜交用 于確定是否存在特定的基礎(chǔ); N o rthern 雜交檢測(cè) 基因是否表達(dá); 斑點(diǎn)雜交用于分析 DNA 片段是 否來源于同一 DNA ; 原位雜交可鑒定細(xì)胞內(nèi)特定 基 因 的 位 置, 常 用 于 診 斷 生 物 和 病 原 學(xué) 研
[1 究。 ][12 ]

1　在動(dòng)物細(xì)菌病診斷中的應(yīng)用現(xiàn)狀 1. 1　質(zhì)粒圖譜分析
質(zhì)粒是螺旋型 DNA 分子, 存在于細(xì)菌的細(xì) 胞質(zhì)中, 與細(xì)菌的染色質(zhì)一樣, 可以復(fù)制保留并 分布于子代細(xì)菌中。 通過現(xiàn)已檢測(cè)到 50 多種細(xì) 菌的質(zhì)粒說明質(zhì)粒在細(xì)菌中是普遍存在的。由于 來自同一菌株的子代細(xì)菌都包含同一數(shù)目、 同一 分子量的質(zhì)粒, 所以質(zhì)粒圖譜可用來鑒定細(xì)菌的 種類, 如用質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶圖譜可以鑒定并 證實(shí)某種動(dòng)物的細(xì)菌性疾病對(duì)人的傳染等。 但
B iacka ll 等證明在引起雞的傳染性法氏囊鼻炎的

1. 4　聚合酶鏈反應(yīng) (PCR ) 技術(shù)
PCR 技術(shù)是一種模擬體內(nèi) DNA 復(fù)制的過

程, 在體外擴(kuò)增特異性 DNA 片段的有效手段。 特異性高和敏感性強(qiáng)等特點(diǎn), 廣 PCR 具有快速、 泛應(yīng)用于畜禽細(xì)菌性疾病的臨床診斷、 菌株鑒 定、 流行病學(xué)調(diào)查。 隨機(jī) PCR 提高了 PCR 技術(shù)應(yīng) 用的廣泛性; 免疫 PCR、 反轉(zhuǎn)錄 PCR、 接頭 PCR、 不對(duì)稱 PCR、 反相 PCR、 鑒定 PCR、 多重 PCR 等 廣泛應(yīng)用于分子克隆、 制造探針和標(biāo)記探針等方 面, 尤其在傳染性病原的檢測(cè)方面發(fā)揮了極大的 優(yōu)勢(shì)。 PCR 技術(shù)對(duì)樣品要求不嚴(yán)格, 純化的核酸 或抽提的核酸均可, 新鮮的或陳舊組織均可, 并 且樣品要求量不大, 這些都有利于 PCR 技術(shù)在畜 禽疾病診斷中的應(yīng)用。PCR 尤其適用于那些培養(yǎng) 困難的細(xì)菌檢測(cè)以及那些抗原性復(fù)雜的細(xì)菌鑒 定。 如通過檢測(cè)毒素來監(jiān)測(cè)產(chǎn)毒素菌株, 如巴氏 桿菌、 肉毒梭菌等。 通過從基因庫中篩選某菌的 特異性雜交片段。 可鑒定該菌的多個(gè)血清型, 如 胸膜肺炎放線桿菌、 沙門氏菌等; 對(duì)于嚴(yán)格厭氧 菌如結(jié)節(jié)雙支桿菌、 豬密螺旋體等, 用 PCR 檢測(cè) 很容易; 對(duì)于培養(yǎng)費(fèi)時(shí), 分離困難的細(xì)菌如支原 體、 副結(jié)核分支桿菌等, 運(yùn)用 PCR 不僅節(jié)約了時(shí) 間而且提高了靈敏度。 然而 PCR 從實(shí)驗(yàn)室走向臨 床應(yīng)用, 仍有許多問題需要解決, 如臨診樣品中
( 尿、 糞便、 胸水、 腹水等) 不同程度含有 PCR 抑制

病原菌、 副雞嗜血桿菌等 26 株細(xì)菌中不含質(zhì)粒,
[1 質(zhì)粒圖譜也就沒有意義了。 ][2 ][12 ]

1. 2 　染色質(zhì) DNA 限制性內(nèi)切酶 (R EA )

分析
染色質(zhì) DNA 經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后, 得到 的 DNA 片段用瓊脂糖凝膠電脈進(jìn)行分離, 每個(gè) 基因組形成的電泳圖譜是特異的, 但所得圖譜比 較復(fù)雜, 可用核酸雜交或探針技術(shù)簡(jiǎn)化這一過
[1 程。 ]

應(yīng)用 R EA 圖譜可區(qū)別致病菌和其它共存的 同種分離株, 也可應(yīng)用 R EA 圖譜證明同一雞場(chǎng) 的不同雞群和在其附近的幾個(gè)雞場(chǎng)暴發(fā)的細(xì)菌 病是否為同一傳染源。 也可用某種細(xì)菌的 RNA 操縱子提取的 rRNA 探針區(qū)別該細(xì)菌的活疫苗 株和野外致病株。但如果一個(gè)屬或一個(gè)種內(nèi)的所 在成員都有相同的 R EA 圖譜, 那么 R EA 圖譜就
[1 不能用于這種疾病的流行學(xué)研究。 ][2 ]

1. 3　分子雜交技術(shù)
王玲, 女, 26 歲, 在讀研究生 收稿日期: 1997- 01- 28

物, 必須對(duì)樣品加以處理, 才能使 PCR 獲得準(zhǔn)確
[2 結(jié)果。 ][3 ][4 ][11 ][9 ]

分子生物學(xué)技術(shù)在獸醫(yī)細(xì)菌學(xué)研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀及前景—王玲

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1. 5　細(xì)菌 DNA 中 G+ C m o l% 含量的測(cè)

構(gòu)建多價(jià)苗乃至多聯(lián)苗, 實(shí)現(xiàn)一針防多病的夢(mèng)
[8 想, 其關(guān)鍵是找出保護(hù)性抗原的保守序列。 ]

定
細(xì)菌 DNA 中 G + C m o l% 含量是細(xì)菌分類 鑒定的一個(gè)重要指征, 可作為細(xì)菌分類的依據(jù)和 判定細(xì)菌科屬間親緣關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn), 同時(shí)也是新發(fā)
[5 現(xiàn)細(xì)菌的鑒定依據(jù)之一。 ]

2. 3　抗病基因轉(zhuǎn)移技術(shù)
用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑼庠纯共』蜣D(zhuǎn)至家禽體
[1 內(nèi), 使之獲得抗病性, 是防治禽病的一條途徑。 ]

2. 4　利用反義 RNA 治病
反 義 RNA 是 一 種 小 分 子, 它 可 與 正 常 的
m RNA 互補(bǔ), 使其不再翻譯成蛋白質(zhì), 因此可將

1. 6　基因探針技術(shù)
基因探針是指能識(shí)別特 ( 別 ) 異堿基序列的 有標(biāo)記的一段單鏈 DNA 或 RNA 分子, 即一段與 被測(cè)定的核苷酸序列互補(bǔ)的帶標(biāo)記的單股核苷 酸。在細(xì)菌性疾病診斷中具有快速、 簡(jiǎn)便、 敏感的 特點(diǎn)。有人預(yù)言, 在生物技術(shù)市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)中, 下一個(gè) 具有吸引力 的 突 破 口 將 是 基 因 探 針。 目 前, 在
Kohne 實(shí)驗(yàn)室中制備了多種臨床應(yīng)用的 DNA 探

特定的反義 rRNA 片段轉(zhuǎn)至染色體中, 使雞獲得
[12 抗病性。 ]

2. 5　特定的核酸切割技術(shù)
特定的核酶只特異地切割某一種 RNA , 使 治病的目 RNA 不能表達(dá)蛋白質(zhì), 從而達(dá)到防病、
[12 的。 ]

針與 rRNA 雜交, 具有高度的特異性, 可檢測(cè)所 有細(xì)菌綱內(nèi)的細(xì)菌、 一個(gè)細(xì)菌科內(nèi)細(xì)菌、 一個(gè)細(xì)
[6 菌屬內(nèi)細(xì)菌或僅對(duì)某一個(gè)種內(nèi)細(xì)菌。 ]

3 　分子生物學(xué)技術(shù)在獸醫(yī)細(xì)菌學(xué)研究中

1. 7 　利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建了一批單
[ 抗用于細(xì)菌學(xué)的診斷方面。13 ] 2　在獸醫(yī)細(xì)菌免疫學(xué)中的應(yīng)用 2. 1　基因免疫

的發(fā)展前景 3. 1 　分子生物學(xué)技術(shù)在細(xì)菌病的診斷中 發(fā)展前景廣闊
在細(xì)菌病的診斷中, 利用分子生物學(xué)技術(shù)可 克服常規(guī)的培養(yǎng)法、 血清學(xué)或單克隆抗體技術(shù)的 許多缺陷。 利用細(xì)菌分離培養(yǎng)法結(jié)果出現(xiàn)緩慢, 因?yàn)樵S多細(xì)菌需經(jīng)過隔夜培養(yǎng), 并且有些細(xì)菌只 能在動(dòng)物體內(nèi)或組織細(xì)胞中培養(yǎng), 這在一般實(shí)驗(yàn) 室是很難進(jìn)行的。實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員經(jīng)常接觸活培 養(yǎng)物, 有被感染的可能, 而用探針檢測(cè)時(shí), 標(biāo)本中 的微生物已被殺死。單克隆抗體與培養(yǎng)法比較不 需細(xì)胞培養(yǎng)而快速完成, 但該法的特異性常常受 到限制, 交叉反應(yīng)的出現(xiàn)和某些抗原變異可造成
[6 檢測(cè)能力的喪失, 使技術(shù)人員難以判定結(jié)果。 ][9 ]

又稱核酸或 DNA 免疫, 是指將帶有目的基 因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到體內(nèi), 誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體, 并引進(jìn)特異性的免疫應(yīng)答。它克服了活苗和滅活
[7 苗的一些缺陷, 具有安全、 有效的特點(diǎn)。 ]

基因免疫所誘發(fā)的免疫應(yīng)答是抗蛋白的, 而 不是抗質(zhì)粒的, 這意味著質(zhì)粒載可重復(fù)地用于釋 放編碼不同蛋白質(zhì)的 DNA , 因而能提供對(duì)多種傳 染病的保護(hù)作用。 基因免疫接種后, DNA 編碼的 蛋白質(zhì)表達(dá)能持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間, 體內(nèi) B 和 T 細(xì)胞的 免疫記錄不斷加強(qiáng), 不僅可誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性免疫 抗體, 而且可同時(shí)激發(fā)機(jī)體細(xì)胞介導(dǎo)的保護(hù)性免 疫即抗原特異性 CTL 的產(chǎn)生。 基因免疫通過對(duì)基因表達(dá)載體攜帶目的基 因進(jìn)行改造, 從而獲得選擇抗原決定簇。 為了獲 得對(duì)異源株的保護(hù)性免疫, 可選擇編碼保守蛋白
[7 的核酸序列。 ][9 ][10 ]

隨著各種新技術(shù)的發(fā)展, DNA 探針診斷技術(shù) 必將越來越快地發(fā)展。目前研究最多的是非放射 性同位素標(biāo)記法和雜交法, 如使試劑盒改進(jìn)得更 簡(jiǎn)單, 即使不經(jīng)訓(xùn)練的人員也能做出正確結(jié)果; 發(fā)展自動(dòng)化的 DNA 探針技術(shù), 可快速大量篩選 臨床標(biāo)本或同時(shí)檢測(cè)幾種不同的病原體。由此可 見, 分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)畜禽細(xì)菌病的早期診斷、
[6 潛伏感染期的診斷起著重要作用。 ][9 ]

2. 2　基因工程苗
2. 2. 1 　基因缺失苗、 亞單位苗和重組基因苗的

3. 2　基因免疫的應(yīng)用前景[ 7 ] [ 8 ] [ 9 ] [ 12 ] [ 13 ]
基因免疫是一項(xiàng)綜合了分子生物學(xué)、 細(xì)胞生 物學(xué)及免疫學(xué)一些前沿研究?jī)?nèi)容的新興生物研 究技術(shù), 由于具有以下幾個(gè)特點(diǎn)而具有廣闊的發(fā) 展前景。

研制及應(yīng)用, 克服了傳統(tǒng)疫苗的一些缺點(diǎn)。
2. 2. 2 　基因工程活載體苗是最活躍、 最有希望

的新疫苗, 可同時(shí)啟動(dòng)細(xì)胞免疫和體液免疫, 可

40 3. 2. 1 　基因免疫由于質(zhì)粒可重復(fù)使用, 加之制

黑龍江畜牧獸醫(yī) 1997 年第 9 期
[7 因, 來解決粘膜免疫問題。 ][12 ][13 ]

造和純化 DNA 重組體比傳統(tǒng)的蛋白純化技術(shù)要 簡(jiǎn)單得多, 具有投資少, 收益大的特點(diǎn), 并且可能 促進(jìn)多聯(lián)苗甚至包含各種病原體的萬能苗的產(chǎn) 生。
3. 2. 2 　基因免疫特別適于那些易變異的或有型

4　參考文獻(xiàn)
1 　汪東江, 陳吉龍. 分子生物學(xué)技術(shù)及其在動(dòng)物

流行病學(xué)中的應(yīng)用. 中國獸醫(yī)科技, 1994, 24 ( 3 ) :
45 46. ～ 2 　羅滿林, 張楚瑜. PCR 技術(shù)在細(xì)菌病診斷中的

別的病原體。保護(hù)性抗原不明確或表達(dá)抗原難以 純化的抗原蛋白, 則可用基因免疫法先進(jìn)行動(dòng)物 實(shí)驗(yàn), 尋找可能具有保護(hù)作用的片段, 再進(jìn)一步 發(fā)展有效的疫苗。
3. 2. 3 　基因免疫由于安全、 有效、 價(jià)廉易得, 省

應(yīng)用. 中國獸醫(yī)雜志, 1996, 22 ( 9) : 50 53. ～
3 　李文剛, 甘孟侯. PCR 技術(shù)在獸醫(yī)學(xué)中的應(yīng)

用. 中國獸醫(yī)雜志, 1994, 20 ( 1) : 53 54. ～
4 　楊永欽. 多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀. 中國獸

醫(yī)科技, 1993, 23 ( 5) , 42 44. ～
5 　韓文瑜, 劉玉斌. 病原細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)技術(shù). 吉林

時(shí)省力, 以及其獨(dú)特的作用效果等方面的優(yōu)點(diǎn), 符合最佳疫苗的條件, 給基因治療和疫苗免疫帶 來了不可估量的前景, 也將為免疫學(xué)帶來一場(chǎng)新 的革命。

科技出版社, 1992, 7: 101 105. ～
6 　林萬明. 基因探針傳染病診斷中的應(yīng)用. 臨床

基因探針診斷實(shí)驗(yàn)技術(shù). 上海科技出版社, 1993,
6: 121 130. ～ 7 　沈正達(dá). 基因免疫及其在傳染病中的應(yīng)用. 中

3. 3　基因工程抗體將得到廣泛應(yīng)用
科學(xué)家們認(rèn)為, 能否將引起重大傳染病的病 原轉(zhuǎn)移到煙草、 茶葉、 蔬菜水果等植物中去, 人們 通過飲茶、 吃蔬菜、 水果獲得植物抗體抵御疾病。 在獸醫(yī)方面, 人們據(jù)已取得的研究成果, 提出今 后的發(fā)展方向如下。
3. 3. 1　 研究生產(chǎn)畜禽重大傳染病病原的基因工
[7 程抗體, 用于臨床診斷和被動(dòng)免疫。 ]

國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜傳染病分會(huì)教學(xué)專業(yè)委員 會(huì)第六次學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編, 泰安, 1996, 9: 5 6. ～
8 　袁世山, 徐宜為. 動(dòng)物基因工程苗研究進(jìn)展及

我國應(yīng)采取的對(duì)策. 中國畜禽傳染病, 1995, 2: 58 ～ 62.
9 　陳如名, 高學(xué)運(yùn). 獸醫(yī)生物技術(shù)研究進(jìn)展及發(fā)

3. 3. 2 　研制基因工程抗體用于獸醫(yī)免疫學(xué)基礎(chǔ)

展動(dòng)向簡(jiǎn)介. 中國獸醫(yī)科技, 1996, 26 ( 8) 38 39. ～
10 　 1 B inn s. 分子生物學(xué)在獸醫(yī)傳染病上的 M M.

理論的研究。

[7 ][10 ]

3. 3. 3 　開展基因工程抗體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究,

應(yīng) 用. 顧 有 方 譯, 國 外 獸 醫(yī) 學(xué) ? 畜 禽 傳 染 病,
1994, 14 ( 3) , 5 7. ～

對(duì)目前免疫效果不好的畜禽傳染病結(jié)合動(dòng)物育
[7 種, 培育出抗病力強(qiáng)的新品種。 ][13 ]

11 　羅滿林, 陳溥言. PCR 技術(shù)及其在病毒性疾

3. 3. 4 　基因工程抗體與生物反應(yīng)器結(jié)合起來,

病診斷中的應(yīng)用. 中國畜禽傳染病, 1993, 5, 61 ～
64.

可將單抗基因?qū)腚u, 通過轉(zhuǎn)基因雞在雞蛋中產(chǎn) 生抗體, 可通過吃雞蛋得到被動(dòng)免疫保護(hù)。
3. 3. 5 　利用微生物能高效表達(dá)單抗基因的特性

12 　王聿木. 禽病研究中的核酸技術(shù). 上海畜牧

獸醫(yī)通訊, 1992, 1, 36 38. ～

與動(dòng)物微生態(tài)工程結(jié)合起來, 利用動(dòng)物體內(nèi)正常 微生物群來表達(dá)某些抗腸道腹瀉細(xì)菌的抗體基

13 　李建凡. 家禽分子生物學(xué)技術(shù)研究進(jìn)展. 國

外畜牧科技, 1995, 22 ( 5) , 53 56. ～

( 007)

1998 年征訂啟事
《河南畜牧獸醫(yī)》 為季刊, 16 開本, 56 頁, 全 年 4 期共收 12 元, 讀者可直接匯款至本刊編輯部 訂閱, 地址: 鄭州市經(jīng)五路 23 號(hào), 河南畜牧獸醫(yī) 雜志社。

《畜牧獸醫(yī)科技信息》 為半月刊, 每月 10、 25

日出版, 自辦發(fā)行。 定價(jià): 每期 0. 9 元, 全年 24 期
21. 60 元, 訂閱者請(qǐng)將款經(jīng)郵局匯至哈爾濱市南

崗區(qū)馬端街 427 號(hào)哈獸研所本刊編輯部, 郵碼:
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