豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)、豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)、豬輪狀病毒病(Porcine rotavirus disease,RVD)是豬場(chǎng)常見(jiàn)的病毒性腹瀉,分別由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)及豬輪狀病毒(Porcine rotavirus,RV)引起的,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。三種病毒引起的腹瀉具有類(lèi)似的傳染途徑和臨床癥狀,感染豬臨床均表現(xiàn)為水樣腹瀉、嘔吐、脫水及新生仔豬的高死亡率,三者流行病學(xué)和病理剖檢也極其相似,但三種病原沒(méi)有共同的抗原性,不能交互免疫,而又有混合感染,也易繼發(fā)其他細(xì)菌性感染,導(dǎo)致仔豬死亡率升高或生長(zhǎng)緩慢。目前,常規(guī)的診斷方法如病毒分離、血清學(xué)診斷方法等存在著耗時(shí)長(zhǎng)、敏感度低的缺陷,已不能滿(mǎn)足現(xiàn)實(shí)臨床診斷需要。多重PCR方法具有敏感性高且可以一次檢測(cè)多種病原的優(yōu)勢(shì),更適于混合感染的快速診斷。在臨床檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)進(jìn)行了免疫的豬群會(huì)出現(xiàn)PED現(xiàn)象,為了檢測(cè)山東省豬場(chǎng)PEDV免疫水平,對(duì)免疫豬進(jìn)行抗體檢測(cè),免疫后的抗體的跟蹤檢測(cè),建立了針對(duì)S基因主要抗原表位的原核表達(dá),并利用S90蛋白建立了間接ELISA方法。本研究共分為3部分:1.PEDV-TGEV-RV多重PCR方法建立本文進(jìn)行了PEDV、TGEV和RV多重RT-PCR檢測(cè)方法的研究。根據(jù)近幾年來(lái)山東主要流行株P(guān)EDV、TGEV和RV的保守基因M、N和VP7分別設(shè)計(jì)了特異性引物,分別擴(kuò)增出預(yù)期的311bp、763bp和516bp的目的片段,成功建立同時(shí)檢測(cè)豬三種常見(jiàn)病毒感染的多重PCR方法。通過(guò)敏感性和特異性的試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)本方法對(duì)PEDV的最高敏感度為30pg,TGEV的最高敏感度為18pg,RV的最高敏感度為42pg,并通過(guò)對(duì)其他常見(jiàn)幾種病原進(jìn)行PCR擴(kuò)增,發(fā)現(xiàn)本方法特異性良好,可以應(yīng)用于臨床樣品檢測(cè)。利用該檢測(cè)方法對(duì)2015年到2016年來(lái)自山東省濟(jì)南、泰安、萊蕪等發(fā)病豬場(chǎng)的412份臨床病料進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明PEDV、TGEV和RV的陽(yáng)性率分別為22.3%、7.28%和1.46%,PEDV與TGEV、PEDV與RV、TGEV與RV雙重混合感染陽(yáng)性率分別為5.34%、1.94%和2.91%,PEDV、TEGV和RV三重感染陽(yáng)性率為4.85%。同時(shí)用文獻(xiàn)報(bào)道的單一RT-PCR法對(duì)以上樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果符合率為100%。結(jié)果表明,建立的三重RT-PCR具有較敏感度和特異性,可用于臨床PEDV、TGEV和RV的檢測(cè)。2.PEDV S90基因的原核表達(dá)與條件優(yōu)化本試驗(yàn)設(shè)計(jì)一對(duì)引物,以PEDV山東流行毒株為擴(kuò)增模板,擴(kuò)增了PEDV的S基因的主要抗原表位區(qū),并連接到原核表達(dá)載體pET-32a(+),構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒,導(dǎo)入表達(dá)菌E.coli BL21(DE3),通過(guò)對(duì)表達(dá)時(shí)間,誘導(dǎo)劑的使用量等條件的摸索,使構(gòu)建的pET32a-S90質(zhì)粒在宿主菌中大量穩(wěn)定的進(jìn)行蛋白表達(dá),通過(guò)對(duì)優(yōu)化條件的摸索得出:最佳的表達(dá)條件誘導(dǎo)劑IPTG終濃度為1mmol/mL的,37℃,220rpm,誘導(dǎo)表達(dá)6h時(shí)蛋白表達(dá)量最大。經(jīng)過(guò)對(duì)菌體蛋白純化獲得純度較高的目的蛋白,Western blot檢測(cè)表明,表達(dá)的重組S90蛋白能與PEDV陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng),不與其他常見(jiàn)豬病陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng),說(shuō)明該蛋白具有一定的反應(yīng)原性。3.PEDV間接ELISA方法的建立和初步應(yīng)用利用純化的原核表達(dá)S90蛋白為包被抗原,建立了檢測(cè)豬體內(nèi)PEDV抗體的間接ELISA方法。優(yōu)化條件為S90蛋白最佳包被量為2μg/mL,4℃孵育過(guò)夜,最佳包被液為5%脫脂奶粉,被檢血清最佳稀釋度為1:100,抗體最佳反應(yīng)時(shí)間為37℃2h,二抗按1:4000稀釋,37℃1.5h,顯色液的最佳終止時(shí)間為室溫15min,陽(yáng)性的Cut-off值為0.204。以建立的間接ELISA方法對(duì)采山東省萊蕪2個(gè)未免疫豬場(chǎng)120頭豬進(jìn)行抗體檢測(cè),總體檢測(cè)抗體為54.15%,其中母豬感染抗體陽(yáng)性率為60%,育成豬抗體陽(yáng)性率為48.3%,抗體陽(yáng)性率不高,存在嚴(yán)重的野毒現(xiàn)象。對(duì)山東省濟(jì)南三個(gè)免疫豬場(chǎng)195頭豬進(jìn)行抗體檢測(cè)和免疫后抗體跟蹤,檢測(cè)結(jié)果顯示,檢測(cè)的血清中PEDV抗體的總陽(yáng)性率為70.3%,其中母豬血清PEDV抗體陽(yáng)性率為64.8%,育成豬血清PEDV抗體陽(yáng)性率為76.7%。跟蹤檢測(cè)豬場(chǎng)免疫后抗體水平消長(zhǎng)規(guī)律,7d抗體開(kāi)始上升,28d達(dá)到最高。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S858.28
文章目錄
中文摘要
Abstract
前言
1.1 豬流行性腹瀉病毒
1.1.1 PEDV概述
1.1.2 PEDV的分子生物學(xué)特性
1.1.3 臨床癥狀及病理變化
1.1.4 PEDV檢測(cè)方法研究進(jìn)展
1.2 豬傳染性胃腸炎病毒
1.2.1 TGEV概述
1.2.2 TGEV基因組成
1.2.3 TGE臨床癥狀及病理變化
1.2.4 TGEV檢測(cè)方法的研究進(jìn)展
1.3 豬輪狀病毒
1.3.1 RV概括
1.3.2 RV的病毒形態(tài)
1.3.3 輪狀病毒分類(lèi)
1.3.4 輪狀病毒檢測(cè)方法
1.4 本研究的目的和意義
2 材料與方法
2.1 材料
2.1.1 毒株與疫苗
2.1.2 菌種和質(zhì)粒
2.1.3 主要試劑
2.1.4 主要儀器
2.1.5 試驗(yàn)中配制的試劑
2.2 方法
2.2.1 PEDV-TGEV-RV單一PCR方法的建立
2.2.2 PEDV-TGEV-RV多重PCR檢測(cè)方法的建立與臨床樣品檢測(cè)分析
2.2.3 PEDV S90蛋白表達(dá)與條件優(yōu)化
2.2.4 PEDV S90間接ELISA檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用
3 結(jié)果與分析
3.1 PEDV、TGEV和RV單一PCR方法的建立
3.1.1 檢測(cè)引物的PCR擴(kuò)增
3.1.2 陽(yáng)性質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果
3.1.3 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化
3.1.4 單一PCR體系及反應(yīng)程序的確立
3.1.5 陽(yáng)性克隆序列測(cè)定
3.2 PEDV-TGEV-RV多重PCR檢測(cè)方法的建立與臨床樣品檢測(cè)分析
3.2.1 多重PCR方法的建立
3.2.2 多重PCR反應(yīng)的特異性
3.2.3 多重PCR反應(yīng)的靈敏性
3.2.4 多重PCR的重復(fù)性試驗(yàn)
3.2.5 樣品檢測(cè)結(jié)果
3.3 PEDV S90蛋白表達(dá)結(jié)果
3.3.1 目的基因RT-PCR擴(kuò)增
3.3.2 原核重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
3.3.3 重組表達(dá)質(zhì)粒陽(yáng)性的鑒定
3.3.4 陽(yáng)性克隆序列測(cè)定
3.3.5 SDS-PAGE分析
3.3.6 誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化
3.3.7 目的蛋白的純化
3.3.8 Western blot鑒定分析
3.4 間接ELISA檢測(cè)方法的建立
3.4.1 蛋白濃度測(cè)定
3.4.2 抗原最適合包被濃度和抗體最佳稀釋度的確定
3.4.3 封閉液的確定
3.4.4 最優(yōu)封閉時(shí)間選擇
3.4.5 最佳血清孵育時(shí)間的確定
3.4.6 二抗最佳稀釋度選擇
3.4.7 底物最佳反應(yīng)時(shí)間的確定
3.4.8 間接ELISA方法的判斷標(biāo)準(zhǔn)的確定
3.4.9 特異性檢驗(yàn)
3.4.10 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.4.11 符合性檢驗(yàn)
3.4.12 臨床樣品檢測(cè)
4 討論
4.1 PCR方法建立與臨床檢測(cè)
4.2 PEDV S90蛋白的原核表達(dá)與條件優(yōu)化
4.3 PEDV S90間接ELISA的研究
5 結(jié)論
6 參考文獻(xiàn)
7 致謝
【相似文獻(xiàn)】
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本文編號(hào)：
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