【摘要】：microRNA(miRNA)是一類重要的非編碼小RNA,在靶基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá),具有明顯的階段性和組織特異性,在動(dòng)物各個(gè)發(fā)育階段的生長發(fā)育和繁殖過程中起作用。香豬作為貴州地方豬品種的優(yōu)秀代表,性成熟早,產(chǎn)仔數(shù)少,目前香豬的繁殖調(diào)控機(jī)理不完全清楚。本文采用組織學(xué)切片技術(shù)研究不同月齡香豬睪丸的顯微結(jié)構(gòu),構(gòu)建四個(gè)月齡香豬睪丸組織小RNA c DNA文庫,通過HiSeq高通量測序技術(shù),結(jié)合生物信息學(xué)分析,鑒定出香豬不同發(fā)育期miRNA的表達(dá)譜,分析差異表達(dá)的miRNA分子類型和結(jié)構(gòu),推測miRNA作用的靶基因和功能,選擇6個(gè)差異表達(dá)的miRNA,研究在不同發(fā)育時(shí)期睪丸以及其它組織的表達(dá)量變化,獲得的主要結(jié)果如下:1、香豬睪丸的發(fā)育特點(diǎn)是4月齡時(shí)可檢測到成熟精子。2、利用HiSeq高通量測序技術(shù),獲得香豬2月齡、3月齡、7月齡和18月齡microRNA表達(dá)譜,每個(gè)表達(dá)譜的高質(zhì)量micro RNA序列接近600萬條。3、從2月齡香豬睪丸RNA文庫中鑒定出254個(gè)已知miRNA和180個(gè)候選mi RNA;3月齡文庫鑒定出251個(gè)已知mi RNA和176個(gè)候選miRNA;7月齡文庫鑒定了227個(gè)已知miRNA和120個(gè)候選miRNA;18月齡文庫鑒定215個(gè)已知mi RNA和100個(gè)候選miRNA。隨機(jī)選擇6個(gè)miRNA分子采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法證實(shí)在相應(yīng)月齡的睪丸組織中都有表達(dá)。4、找到1165種miRNA在四個(gè)時(shí)期睪丸文庫中的表達(dá)量有顯著差異,其中2月齡文庫中有74個(gè)miRNA的表達(dá)量顯著低于3月齡文庫;2月齡文庫miRNA的表達(dá)量顯著高于7月齡文庫和18月齡文庫,分別有219個(gè)和224個(gè)miRNAs的表達(dá)量上調(diào)。3月齡文庫miRNA的表達(dá)量顯著高于7月齡文庫和18月齡文庫,分別有268個(gè)和272個(gè)miRNAs的表達(dá)量上調(diào)。7月齡文庫miRNA的表達(dá)量顯著高于18月齡文庫,有21個(gè)miRNAs的表達(dá)量上調(diào)。2月齡香豬睪丸中的miRNA表達(dá)量最高,18月齡中的表達(dá)量最低。5、使用mirecord軟件對10種差異表達(dá)的miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測,共得到1953個(gè)靶基因,經(jīng)KEGG Pathway分析,這些靶基因可能參與香豬睪丸的發(fā)育和精子的發(fā)生過程。6、經(jīng)實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測,6個(gè)mi RNAs在不同發(fā)育時(shí)期的睪丸組織中均表達(dá),總體趨勢是,隨著香豬睪丸從1月齡增加到7月齡,Let-7a-5p和miR-10的表達(dá)量先升高后下降;mi R-202表達(dá)量的逐漸降低;mi R-200b表達(dá)量先下降后上升;miR-145-5p與miR-199a-3p的表達(dá)量沒有明顯規(guī)律。本文對香豬不同月齡睪丸組織中差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行了系統(tǒng)的研究,有助于解析香豬睪丸發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制。
[Abstract]:MicroRNA (miRNA) is a kind of important non-coding small RNA, which regulates the expression of genes at the post-transcriptional level of target genes. It has obvious phase and tissue specificity and plays an important role in the growth and reproduction of animals at various stages of development. As an excellent representative of Guizhou local pig breeds, Xiang pig has early sexual maturity and low litter size. At present, the reproductive regulation mechanism of Xiang pig is not completely clear. In this paper, the microstructures of testis of fragrant pigs at different months of age were studied by histological section technique, and the small RNA c DNA library of testicular tissue of four-month-old Xiang pigs was constructed. HiSeq high-throughput sequencing technique and bioinformatics analysis were used to analyze the microstructures of testis. The expression profiles of miRNA in different developmental stages of Xiang pig were identified. The molecular types and structures of miRNA were analyzed, and the target genes and functions of miRNA were speculated. Six differentially expressed miRNA, studies were selected to study the changes of expression levels in testis and other tissues at different developmental stages. The main results were as follows: 1. The characteristics of testicular development in Xiang pigs were that mature spermatozoa could be detected at the age of 4 months. Using HiSeq high-throughput sequencing technique, the microRNA expression profiles were obtained at the age of 2 months, 3 months old, 7 months and 18 months, respectively. The high quality micro RNA sequence of each expression profile was close to 6 million. 254 known miRNA and 180 candidate mi RNA;3 month-old libraries were identified from 2-month-old Xiangxiang pig testicular RNA library. 251 known mi RNA and 176 candidate miRNA;7 month-old libraries were identified. 227 known miRNA and 120 candidate miRNA;18 month-old libraries were identified for 215 known mi RNA and 100 candidate miRNA.. Six miRNA molecules were randomly selected and confirmed to be expressed in testis tissues of corresponding months by real-time fluorescence quantitative PCR. The results showed that there were significant differences in the expression of 1165 kinds of miRNA in testis library in four periods. 74 miRNA expression levels in 2-month-old libraries were significantly lower than those in 3-month-old libraries and 2-month-old libraries, and the expression levels of miRNA in 2-month-old libraries were significantly higher than those in 7-month-old libraries and 18-month-old libraries. 219 and 224 miRNAs up-regulated the expression of miRNA in three-month-old library compared with 7-month-old library and 18-month-old library, respectively. 268 and 272 miRNAs expression levels were significantly higher than that of 18-month-old library, respectively, and the expression of miRNA in 7-month-old library was significantly higher than that in 18-month-old library. The expression of miRNA in the testis of 21 miRNAs was the highest and the lowest among 18 months of age. The target genes of 10 differentially expressed miRNA were predicted by mirecord software. A total of 1953 target genes were obtained by KEGG Pathway analysis. These target genes may be involved in testicular development and spermatogenesis of Xiang pig. By real-time quantitative RT-PCR detection, 6 mi RNAs were expressed in testicular tissues of different developmental stages, and the general trend was: With the increase of testis from 1 month to 7 months, the expression of Let-7a-5p and miR-10 increased first, then decreased gradually. The expression of miR-200b decreased first and then increased. There was no obvious regularity in the expression of miR-145-5p and miR-199a-3p. In this paper, the differential expression of miRNA in the testis of Xiang pig at different ages was systematically studied, which was helpful to explain the molecular regulation mechanism of testicular development in Xiang pig.
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S828

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本文編號：2242299